CHƯƠNG III NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG DUNG DỊCH HOẠT HÓA ĐIỆN HÓA TRONG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG CHĂN NUÔI LỢN
III.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU VÀ PHÂN TÍCH MẪU III.2.1 Đối tượng nghiên cứu:
III.2.1 Đối tượng nghiên cứu:
- Không khí khu vực chăn nuôi (chỉ tiêu: NH3,H2S,Tổng vi khuẩn hiếu khí; Tổng nấm).
- Bề mặt máng cho lợn ăn (chỉ tiêu: Tổng vi khuẩn hiếu khí; Tổng nấm; E.coli; Coliform).
- Nước cấp cho toàn trại và nước thải chăn nuôi (chỉ tiêu: Tổng vi khuẩn hiếu khí; E.coli; Coliform).
III.2.2 Lập kế hoạch thực hiện, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu.
Căn cứ vào kế hoạch dự kiến cho mỗi đợt lấy mẫu cụ thể, phòng kiểm nghiệm cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ phục vụ cho việc lấy mẫu như: Ống nghiệm, đĩa peptri vô trùng, tăm bông, đèn cồn, túi PE, găng tay, bình thủy tinh vô trùng hoặc bình nhựa vô trùng, bút dùng mực chịu nư- ớc, bật lửa, dây thun, thùng cách nhiệt…
Chuẩn bị các biểu mẫu cần thiết.
TT Tên dụng cụ Mục đích sử dụng
1 Bình thủy tinh hoặc chai nhựa vô trùng
Lấy mẫu nước
2 Tăm bông vô trùng Lấy mẫu bề mặt máng ăn
3 ống nghiệm chứa dịch pha loãng đã vô trùng (1)
Lấy mẫu bề mặt máng ăn 4 Đĩa petri chứa môi trường vô
trùng
Lấy mẫu không khí trong khu vực chăn nuôi 5 Bình xịt cồn Khử trung tay và dụng cụ lấy mẫu 6 Thẻ nhận diện mẫu Các thông tin chi tiết về mẫu
7 Thùng cách nhiệt Bảo quản mẫu trong nước đá khi vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm
8 Băng keo Bao kín thùng cách nhiệt bảo quản mẫu 9 Bút viết mực chịu nước Ghi các thông tin nhận diện mẫu 10 Bật lửa, đèn cồn, pipét, đầu col,
panh
Lấy mẫu bề mặt
11 đồng hồ bấm giờ Lấy mẫu không khí
III.2.3 Thực hiện lấy mẫu: III.2.3.1 Mẫu nước
- Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng vòi nước để khử trùng. - Mở van cho nước chảy khoảng 1 phút.
- Dùng bình xịt cồn khử trùng tay và dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quang miệng bình thuỷ tinh chứa mẫu.
- Mở nắp bình hứng nước từ vòi đến 2/3 thể tích bình chứa. Chú ý không để nước chảy tràn ra miệng bình.
- Vặn kín nắp bình.
- Cho bình đã lấy mẫu vào túi PE vô trùng (sau khi đã dùng cồn khử trùng bình đựng mẫu). Ghi tên vị trí vòi vào thẻ nhận diện mẫu và cho thẻ vào túi chung với bình chứa mẫu. Buộc kín miệng túi bằng dây thun hoặc bằng kim bấm.
- Đối với nước thải, dùng chai vô trùng nhúng ngập xâu trong xô từ 5 – 10cm so với mặt nước..
III.2.3.2 Lấy mẫu bề mặt máng ăn.
- Dùng cồn khử trùng tay.
- Đặt miếng gạc vô trùng diện tích 3cm x 3cm lên bề mặt máng ăn.
- Dùng Micropipet hút 0,5 – 1 ml dịch pepton nhỏ đều lên bề mặt miếng gạc.
- Sau khoảng 1 phút dùng kẹp vô trùng gắp miếng gạc vào ống nghiệm (thao tác gần ngọn lửa đèn cồn) và vặn chặt nắp ống nghiệm. Chú ý không để miếng gạc chạm vào miệng ống nghiệm.
- Cho ống nghiệm chứa mẫu đã lấy mẫu vào một túi PE vô trùng. Ghi các thông tin về vị trí lấy mẫu vào thẻ nhận diện. Cho thẻ vào túi chung với ống mẫu. Buộc kín miệng túi bằng dây thun hoặc băng kim bấm.
- Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt có đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu. - Đánh dấu vị trí đã lấy mẫu để tránh lấy lặp lại cùng một vị trí.
III.2.3.3 Mẫu vệ sinh không khí.
- Chọn vị trí đặt mẫu có tính đại diện trong chuồng nuôi. - Dùng cồn khử trùng tay và bề mặt vị trí cần lấy mẫu.
- Đặt đĩa peptri có chứa môi trường thạch thích hợp đã khử trùng vào vị trí cần lấy mẫu.
- Sau khoảng thời gian 2 phút và 5 phút đối với đĩa thạch phân tích chỉ tiêu Tổng vi khuẩn hiếu khí và Tổng nấm, đậy nắp lại. Cho đĩa vào túi PE vô trùng.
- Dùng kim bấm bấm miệng túi.
- Ghi nhận thời gian và địa điểm lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu. Bấm thẻ vào miệng túi chứa mẫu. Cho túi chứa mẫu vào một tỳi PE khác. Cột kín miệng túi băng dây thun hoặc kim bấm.
Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt. Cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu.
III.2.3.4 Bảo quản mẫu
Mẫu được cho vào túi PE chuyên dùng, buộc kín miệng, đặt trong thùng cách nhiệt và bổ sung đá để duy trì nhiệt độ bảo quản không quá 50C.
Cần chuyển mẫu về phòng kiểm nghiệm để tiến hành phân tích trong thời gian sớm nhất có thể.
III.2.4 Chuẩn bị môi trường và phân tích các chỉ tiêu III.2.4.1 Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí
Nguyên tắc
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 370C/ 24h ± 2 giờ.
Môi tr ường nuôi cấy và dịch pha loãng
- Dung dịch pha loãng : Saline Pepton Water (SPW). - Môi trường nuôi cấy: Plate count agar (PCA).
Thiết bị chính
Tủ ấm 37,0 ± 1,00C.
Chuẩn bị mẫu
- Sau khi tiếp nhận mẫu kiểm tra điều kiện bao gói, bảo quản và vận chuyển mẫu, cho mẫu vào các khay vô trùng và đưa vào buồng vô trùng.
- Tiến hành pha loãng tới 1/10, 1/100, 1/1000....tuỳ thuộc mức độ nhiễm bẩn dự kiến của mẫu sao cho khi nuôi cấy mỗi đĩa chỉ mọc khoảng 30 – 300 khuẩn lạc.
Đổ đĩa
Chuyển 1ml dịch mẫu sau khi đồng nhất hoặc đã pha loãng ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng, mỗi nồng độ một đĩa.
Trong 15 phút, đổ vào mỗi đĩa 15 – 20ml môi trường nuôi cấy (PCA) đã được làm nguội tới 450C.
Trộn đều dịch mẫu và môi trường nuôi cấy bằng cách lắc tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ.
Sử dụng 1 đĩa đối chứng để kiểm soát bằng cách lấy 1ml dịch pha loãng (nước muối sinh lý), cho vào đĩa petri, thêm 15 – 20ml môi trường PCA và nuôi ủ cùng điều kiện như các đĩa mẫu.
Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang để hỗn hợp dịch mẫu và môi trường đông lại.
Nuôi ủ
Đĩa được lật ngược và ủ trong 24h ± 2 giờ ở 37,0 ± 1,00C.
Tính kết quả
Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với môi trường quan nghịch giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó. Chỉ đếm những đĩa có số khuẩn lạc mọc riêng biệt và có từ 15 đến 300 khuẩn lạc mỗi đĩa.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu (X) được tính ở 2 độ pha loãng liên tiếp theo công thức sau:
X = ∑C/[(n1+0,1n2)d]
Trong đó:
∑C - tổng số khuẩn lạc ở hai độ pha loãng được đếm; n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất;
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai;
III.2.4.2 Định lượng Nấm
Quy trình tương tự như định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí ở đây môi trường định lượng thay PCA = SABOURAUD – 2% Dextrose Broth.
III.2.4.3 Định lượng Coliform và E.coli
Nguyên tắc
Coliform và E.coli được xác định bằng cách đếm số khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa chứa môi trường Chromocultđ Coliform Agar
(Merck 1.8616 – 500). Kết quả được biểu thị bằng số Coliform hoặc E. coli trên 1ml mẫu chưa pha loãng hoặc trên 1cm2 bề mặt lấy mẫu.
Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng
- Dung dịch pha loãng : Saline Pepton Water (SPW). - Triptone Soya Agar (TSA)
- Thạch Coliform_agar. Thiết bị chính : - Tủ ấm 37,0 ± 1,00C. - Nồi hấp thanh trùng. - Tủ sấy 1650C Đổ đĩa
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Đổ vào mỗi đĩa khoảng 5ml môi trường Triptone Soya Agar (TSA) ở 45,0 ± 0,50C, sau đó để nguội và đổ vào thêm 10 ml môi trường Chromocult Coliform agar. Lắc tròn đĩa xuôi và ngợc chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần.
Nuôi ủ
Đọc kết quả
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dới 150 sau 24 giờ nuối cấy. Khuẩn lạc coliform dặc trưng trên môi trường Coliform_agar có màu đỏ tía, đường kính khoảng 0,5 mm, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ do tủa. Đếm các khuẩn lạc Coliform đặc trưng trên những đĩa có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để quy về số Coliform trong1ml mẫu. Sau 24 giờ khuẩn lạc E.coli trên môi trường coliform_agar có màu tím xanh.
III.2.4.4 Tính toán kết quả: Sau khi lấy mẫu và nuôi ủ ở nhiệt độ thích hợp, kết quả phân tích được tính toán như sau: Tổng vi khuẩn hiếu khí (tổng nấm) X trong 1m3 không khí được tính theo công thức (TCVN 5376 - 1991):
X = (A x 100 x 100)/(S x K) Trong đó:
A – Số khuẩn lạc trung bình của 5 hộp nồng S – diện tích đĩa thạch, cm2
K – hệ số thời gian (1, 2 hoặc 3 tuỳ thuộc vào thời gian mở đĩa ) +) 1 tương ứng với 5 phút
+) 2 tương ứng với 10 phút… 100 – diện tích quy ước, cm2
100 – hệ số tính chuyển thành m3
III.2.5 Khử trùng, khử mùi chuồng nuôi.
Trước khi thực hiện Dự án, công việc khử trùng được thực hiện 2lần/1 tuần. Hoá chất dùng khử trùng là Benkocid nồng độ 1% với liều lượng 100ml/m2 bề mặt chuồng nuôi. Khi thực hiện Dự án, công việc khử trùng được thực hiện 2ngày/ lần. Sử dụng dung dịch anôlít làm hoá chất khử trùng.
Dung dịch anôlít được sử dụng có nồng độ clo hoạt tính >250mg/l (thường nằm trong khoảng 280÷300mg/lít).
Dùng máy phun áp lực phun sương đều dung dịch anôlít vào toàn bộ không gian chuồng nuôi, từ mặt nền cho tới trần. Liều lượng 300ml/m2 (tính theo diện tích bề mặt chuồng nuôi).
Phương pháp lấy mẫu phân tích (lấy mẫu trước và sau khi xử lý để đánh giá hiệu quả của dung dịch anôlít):
- Mẫu vi sinh: Lấy mẫu bằng phương pháp đặt đĩa thạch, chiều cao đặt đĩa khoảng 80cm so với mặt nền chuồng, mở đĩa trong các khoảng thời gian khác nhau đối với các loại vi sinh vật khác nhau (đối với chỉ tiêu Tổng số vi khuẩn hiếu khí thời gian mở đĩa là 2 phút, đối với chỉ
tiêu Tổng nấm thời gian mở đĩa là 5 phút). Sau đó, đĩa thạch được nuôi cấy và phân tích trong phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn 10 TCN 681 - 2006.
- Vị trí lấy mẫu: khu lợn nái, khu lợn con, khu lợn thịt.
- Khu vực Lợn nái: 4 vị trí x 2 c/t = 8 đĩa (4 đĩa nấm + 4 đĩa VKTS) Hình 5: Phun khử trùng chuồng lợn con
- Khu vực lợn con sau cai sữa và khu lợn thịt : 4 vị trí x 2 c/t = 8 đĩa (4 đĩa nấm + 4 đĩa VKTS) Quạt 5m 5m 1 2 3 4 4 3 2 1 quạt
Hình 6: Lấy mẫu NH3, H2S, Nấm và Tổng Vi khuẩn hiếu khí
III.2.6 Khử trùng các bề mặt, dụng cụ chăn nuôi.
Tại trang trại Hoàng Liễn, các bề mặt cần được khử trùng như: Bề mặt chuồng nuôi, các bề mặt tường bao quanh, các vách ngăn, trần, dụng cụ chăn nuôi…
Thời gian thực hiện khử trùng: 1 – 2 ngày/lần.
- Đối với các bề mặt có chất liệu bằng bê tông (mặt nền chuồng nuôi khu lợn con, khu lợn thịt và một số ô khu lợn nái), các bề mặt được về sinh sạch khỏi các chất bẩn, dùng bình phun hạt to phun đều dung dịch anôlít lên các bề mặt, liều lượng tiêu tốn 200 ÷ 300 ml/m2 bề mặt.
- Đối với các dụng cụ có thể tháo rời, nhúng ngập chúng trong dung dịch anôlít trong thời gian 30 phút.
- Các bề mặt bằng nhựa như các miếng sàn ở khu lợn đẻ được khử trùng bằng cách dùng khăn nhúng dung dịch anôlít và lau ướt đều các bề mặt. Liều lượng tiêu tốn 200 ÷ 300ml/m2.
Đối với các máng ăn bằng Inox cũng được khử trùng bằng phương pháp lau khăn nhúng dung dịch anôlít sau khi máng được vệ sinh sạch các chất bẩn và thức ăn thừa (Thời gian thực hiện: 1lần/ngày)
Đối với các chuồng nuôi vừa xuất bán hoặc chuẩn bị đưa vào nuôi lứa mới cần được khử trùng. Các bề mặt cần được vệ sinh khỏi các chất bẩn, dùng máy phun hạt to phun ướt đều
dung dịch anôlít lên các bề mặt, liều lượng phun 200÷300ml/m3. Tiến hành phun khử trùng 2 lần, lần sau cách lần trước 30 phút
Để đánh giá khả năng khử trùng của dung dịch anôlít đối với các bề mặt, trong Dự án này chúng tôi chọn máng cho lợn ăn bằng Inox là đối tượng nghiên cứu. Đây là nơi chứa nhiều loại vi sinh gây bệnh cho vật nuôi.
Máng ăn sau khi sử dụng được lau sạch các chất bẩn bằng khăn sạch.
Sử dụng dung dịch anôlít để khử trùng: Dùng khăn nhúng dung dịch anôlít lău ướt đều bề mặt máng, để khô 30 phút tiến hành lấy mẫu.
Phương pháp lấy mẫu: Lấy mẫu bằng cách áp miếng gạc vô trùng (diện tích 3cm x 3cm) lên bề mặt máng trong thời gian 1 phút. Dùng kẹp vô trùng đưa miếng gạc vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch Peptone sau đó bảo quản lạnh bằng ướp đá. Ống nghiệm được nuôi cấy và phân tích tại phòng thí nghiệm.
III.2.7 Khử trùng nước cấp cho toàn trại.
Nguồn nước cấp cho toàn trại trước khi khử trùng có mật độ E.coli và Coliform rất cao từ 102 đến 104 cfu/100ml, trong khi đó theo TCVN 6187-1996 (ISO 9308-1990) Coliform tổng số 30MPN/100ml; E.coli 0 MPN/100ml
1- Giếng khoan 2- Bơm cấp 1 (7,5m3/h)
3- Bể lọc cát cấp 1 4- Bể chứa 1
5- Bơm cấp 2 (7m3/h) 6- Bể lọc cát cấp 2
7- Bể chứa nước cấp dẫn đi toàn trại 8- Nhà để thiết bị điện hoạt hoá
9- Vị trí cấp dung dịch máy anôlít máy B-20010- Vị trí cấp dung dịch anôlít máy D-120 (42lít/h)
Trên đây là sơ đồ hệ thống cấp nước của trang trại Hoàng Liễn: Nước được bơm từ giếng khoan qua hệ thống lọc cát cấp 1 để lọc bùn cặn và một phần sắt kết tủa. Sau đó nước được đưa vào bề chứa 1. Bơm cấp 2 có nhiệm vụ đưa nước lên bể lọc cát cấp 2. Tại đây, nước được hoà trộn với dung dịch anôlít trước khi vào bể lọc. Sau đó nước được đưa vào bể chứa để cấp cho toàn trại.
Chất lượng nước cấp của trang trại Hoàng Liễn:
- Nồng độ Mangan từ 1,49 ÷ 2,03 mg/lít ( TCCP (Tiêu chuẩn cho phép): 0,5) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cấp cho các dãy trại Hình 2: Sơ đồ hệ thống cấp nước của trang trại Hoàng Liễn
- Nồng độ Sắt từ 1,69 ÷ 3,35 mg/lít (TCCP: 0,5)
- Nồng độ Amôni từ 2,85 ÷ 9,12 mg/lít, có thời điểm lên tới 18,21mg/lít (TCCP: 1,5) - Độ cứng toàn phần từ 450÷550 mg/lít (TCCP: 300)
Nhìn vào sơ đồ hệ thống cấp nước ta thấy nước cấp của trang trại được khử trùng 2 lần:
- Khử trùng lần 1 bằng dung dịch anôlít của máy B – 200 có nồng độ clo hoạt tính 700 ÷
900mg/l, liều lượng 12l/h (chỉ cấp khi máy B – 200 đang hoạt động). Nhìn chung tại đây, do hàm lượng chất hữu cơ, Sắt và Mangan cao và dung dịch anôlít chỉ cấp trong thời gian máy hoạt động nên nước sau hệ lọc không còn Clo dư chưa đủ khả năng khử trùng nước cấp cho trại
- Khử trùng lần 2 bằng dung dịch anôlít được sản xuất từ máy D-120. Dung dịch anôlít được bơm định lượng OBL (công suất 75lít/giờ) điều chỉnh ở mức 42lít/ giờ hoà trộn với đầu ra của bơm cấp 2 (công suất 7m3/giờ) trước khi vào bể lọc cát cấp 2. Liều lượng anôlít dùng để khử trùng trung bình là 6lít anôlít/m3 nước cấp. Nguyên lý hoạt động khử trùng: Khi bơm cấp 2 bơm nước lên hệ lọc cát cấp 2 thì bơm định lượng dung dịch anôlít OBL cùng được hoạt động.
Phương pháp lấy mẫu phân tích:
- Vị trí lấy mẫu: Nước được lấy tại đầu ra của hệ lọc cát cấp 2 vào bể chứa, lấy tại các đầu vòi cho lợn uống khu lợn nái, khu lợn con và khu lợn thịt.
- Sử dụng các chai nhựa vô trùng hứng nước tại các đầu vòi. Đối với các đầu vòi cho lợn