Hình 7.6: Hệ thống Real-time PCR [9]
Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR
- Cho 2 µl dịch ly trích ADN cần phân tích vào các ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 µl.
- Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
- Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
- Đối với chuẩn: sử dụng 5 chuẩn có hàm lượng bản sao WSSV theo thứ tự lần lượt từ 105 bản sao/ 2 µl; 104 bản sao/ 2 µl; 103 bản sao/ 2 µl; 102 bản sao/ 2 µl;
10 bản sao/ 2 µl. Đối với mỗi chuẩn, dùng micropipette hút 2 µl từng chuẩn cho vào mỗi ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu. Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu. Mẫu xét nghiệm chứa nhiều ADN đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít ADN đích. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ ADN chuẩn. Nồng độ ADN trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn.
Hệ thống này hoạt động theo nguyên tắc sau:
Nguồn chiếu sáng qua kính lọc kích thích và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích này giúp chất chỉ thị huỳnh quang tương ứng với số DNA đích trong ống phản ứng ánh sáng. Ánh sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng.Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh sáng có bước song thích hợp.Sau đó,ánh sáng sẽ qua bộ phận khuếch đại tín hiệu,cuối cùng phát hiện nhờ đầu lọc CCD camera
Nguyên lý định lượng của kỹ thuật Real - time PCR
Để định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao ban đầu. Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được (pha log hay pha cấp số). Tại thời điểm này, đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) phải cắt tất cả các đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang đo được và số chu kỳ. Tại vị trí cắt này, tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị trí đó.
Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định ở trên) và nồng độ bản sao của các chuẩn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được đối chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn
biểu diễn mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đối chiếu này sẽ cho giá trị log số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.X + b ( Y: chu kỳ ngưỡng, X: log số bản sao ban đầu). Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ quy đổi ra số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm.
Hình 7.7 : Biểu đồ biểu diễn khuếch đại cường độ huỳnh quang
Ưu và nhược điểm:
Ưu điểm của kỹ thuật này là khả năng định lượng chính xác số ADN tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng Real - time PCR xảy ra [13]
- Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR.
- Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả.
- Độ nhạy cao. - Độ đặc hiệu cao.
- Ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm.
Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao
Ứng dụng
Real - time PCR cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền thống. Nhờ khả năng thu nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số ADN đích ở pha cấp số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống [12]:
- Định lượng hàm lượng virus. - Định lượng mức độ biểu hiện gen. - Phát hiện tác nhân gây bệnh.
- Xác định kiểu gen (genotyping).
- Ứng dụng hiệu quả trong trị liệu thuốc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng vai trò rất quan trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này. Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi đang là mối quan tâm chung của ngành Thủy sản. Một trong những ứng dụng đáng được quan tâm hiện nay đó là sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi.
Cách đọc kết quả Real - time PCR
Kết quả sau khi thực hiện Real - time PCR được xử lý trên phần mềm iQ version 3.1 của máy iCycler iQ và phần mềm excel.
Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR được phân tích qua đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu.
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Trong suốt thời gian chạy chương trình Real - time PCR, ta có thể nhận biết sự biểu hiện nồng độ ADN của WSSV trong các mẫu thử bằng cách quan sát các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang trên màn hình vi tính. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ để biết mẫu dương tính và mẫu âm tính
Hình 7.8: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ
Hình 7.9 : Đồ thị biểu diễn đường chuẩn
Một số thí nghiệm của phương pháp PCR Thí nghiệm 1:
sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV
Mục đích
Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time PCR.
Tiến hành
15 mẫu tôm (8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV) đã qua kiểm tra PCR và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được thử nghiệm qua Real - time PCR.Các mẫu tôm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5 chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của WSSV cho vào hỗn hợp 48 µl Real - time PCR.Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR
Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với WSSV. Kết quả chạy Real - time PCR được đối so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đó bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Số bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường chuẩn và cho kết quả ở bảng số liệu xuất kết quả sau khi chạy mẫu.
KẾT QUẢ:
Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu dương tính thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên đồ thị
Hình 7.10:Đồ thị biễu diển mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kì của 12 mẩu tôm sú
Hình ảnh trên thể hiện rõ các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu đều vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền), điều này cho thấy các mẫu tôm đều bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Các mẫu: 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm WSSV nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất sớm từ chu kỳ 17 đến 21. Các mẫu còn lại nhiễm WSSV nhẹ đến trung bình thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 33 đến 39.
Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 3 mẫu âm tính thu được qua Hình
Hình 7.11: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 3 mẫu tôm sú
Hình trên cho thấy đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 13 nằm dưới đường baseline subtracted cho kết quả âm tính. Hai mẫu 14 và 15 có tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted ở chu kỳ ngưỡng rất muộn: 41,73 và 40,64, chứng tỏ các mẫu này nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ.
Thí nghiệm 2:
khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR Mục đích
Khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của phương pháp Real - time PCR.
Tiến hành
Chọn ngẫu nhiên hai mẫu nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức độ nặng từ thí nghiệm 2, tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, pha loãng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha loãng bậc 10 (giống như tiến hành pha loãng mẫu ở thí nghiệm 1) được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-3. Thực hiện phản ứng Real - time PCR ở các nồng độ pha loãng của cả hai mẫu: ở nồng độ bắt đầu pha loãng (100) và ở mỗi nồng độ pha loãng (10-1, 10-2, 10-3) tiến hành lặp lại 3 lần. Khi thực hiện Real - time PCR, 5 chuẩn được chạy kèm để định lượng số bản sao của WSSV theo từng nồng độ pha loãng. Ở từng nồng độ pha loãng, 2 µl mẫu đã vortex được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng 48 µl hỗn hợp Real-time PCR.
Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các số bản sao trung bình ở các nồng độ pha loãng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến tính về khả năng định lượng của Real - time PCR. Căn cứ vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha loãng, log số lượng bản sao ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha loãng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha loãng, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ
Thí nghiệm 3:
ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mục đích
Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra sơ khởi tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú giống, và kiểm tra mức độ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thương phẩm và tôm bố mẹ.
Tiến hành
30 mẫu tôm thu thực tế từ vùng nuôi tôm ở Bến Tre và Bạc Liêu được tách chiết ADN qua quy trình ly trích xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được chạy kèm với 5 chuẩn để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng. Thí nghiệm này được lặp lại 2 lần qua Real - time PCR. Sau khi ly trích xong, 2 µl mẫu được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR. Dựa vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của các mẫu trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ và các hiển thị của mẫu trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn để xác định là mẫu dương tính hay âm tính với WSSV và số lượng bản sao ban đầu của WSSV.
Hình 7.13: Mô hình chung cho kỹ thuật chạy PCR
Kết luận và kiến nghị:
Kết luận:
Sau khi thực hiện đề tài, qua các thí nghiệm,ta nhận thấy:
Real - time PCR có thể ứng dụng để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên tôm sú với khả năng phát hiện (1 bản sao) cao hơn các phương pháp khác. Hơn nữa, Real -
time PCR còn cho phép định lượng số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng mà các phương pháp khác không có khả năng thực hiện.
Phương pháp Real - time PCR có khả năng định lượng chính xác số lượng bản sao của WSSV với độ lặp lại cao.Độ nhạy của phương pháp Real - time PCR cao. Tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú ở các giai đoạn nuôi qua kiểm tra bằng Real – time PCR có thể cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ nhiễm được công bố qua xác định bằng các phương pháp khác.
Kiến nghị:
Nên sử dụng phương pháp Real – time PCR để kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú thay cho các phương pháp khác.
Không thả nuôi tôm giống bị nhiễm WSSV.
Không sử dụng tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV để sản xuất tôm giống.
Kiểm tra tôm nuôi thương phẩm định kỳ trong quá trình nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp.