Theo Too H. P. (2001) các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm:
- Primer
- Bốn dNTP (2’– deoxynucleoside – 5’ – triphosphate): dATP, dTTP, dGTP, dCTP
- Taq polymerase - Dung dịch đệm - Mg2+
- Chất phụ trợ (additive): được sử dụng để tăng hiệu quả khuếch đại Hoá chất Nồng độ Mẫu DNA đích 5-10 ng Primer xuôi 0.5 µg Primer ngược 0.5 µg Enzim 1 – 2.5 đơn vị/100µl dNTP 20-200 µM Dung dịch đệm 0.2-2.5 mM Tag polimerase 0.5 µl H2O 27.5 µl 7.4. Các bước phản ứng PCR [2]
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), phản ứng PCR gồm các bước:
Bước 1: trong dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 940 C – 950 C trong vòng 30 giây – 1 phút.Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400 C – 700 C, tùy thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).
Bước 3: nhiệt độ được tăng lên đến 720 C giúp ADN polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự ADN cần khuếch
đại và đặc tính của Taq polymerase, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân.
Hình 7.5: Quy trình của phản ứng PCR