2. Mục tiêu của ựề tài
2.4.1.Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
Gồm gà tây thắ nghiệm (dùng ựể thực hiện các thắ nghiệm) và lô ựối chứng (không sử dụng vacxin).
* Thắ nghiệm 1: Xác ựịnh mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể thụ ựộng của gà tây con với hàm lượng kháng thể chủ ựộng của gà tây mẹ tại các thời ựiểm sau khi tiêm vacxin ND - Emulsion trước khi gà tây mẹ vào ựẻ.
đối tượng n Kiểm tra hiệu giá HI
Gà tây mẹ 10
Gà tây con 10
Tiến hành lấy mẫu máu của gà tây mẹ (trên ựàn gà tây sinh sản nuôi tại trạm Cẩm Bình) tại các thời ựiểm sau khi tiêm vacxin 1,2,3,4,5,6,7 tháng (tiêm trước khi vào ựẻ) với số lượng 10 mẫu/1 lần. đồng thời tiến hành lấy mẫu máu của những con con nở ra từ trứng của những con mẹ tại các thời ựiểm trên với số lượng 10 mẫu/lần.
* Thắ nghiệm 2: Xác ựịnh diễn biến kháng thể thụ ựộng Newcastle ở gà tây con. Từ kết quả của thắ nghiệm trên, tiến hành lấy mẫu máu của gà tây con nở từ trứng của gà tây mẹ sau khi tiêm vacxin tại các thời ựiểm 1,3,4,5,7 tháng ựể kiểm tra hiệu giá kháng thể thụ ựộng bằng phản ứng HI tại các thời ựiểm gà tây con ựược 1, 3, 5, 7, 9 Ầ ngày tuổi, số lượng mẫu: 10 mẫu/lần.
n Thời ựiểm kiểm tra hiệu giá HI (log2) ở gà tây con
(ngày tuổi)
10 1 3 5 7 9 Ầ
Trên cơ sở diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ựộng xác ựịnh thời ựiểm thắch hợp dùng liều vacxin ựầu tiên cho gà tây con (khi HI ≤ 3log2).
* Thắ nghiệm 3: Xác ựịnh hiệu giá kháng thể Newcastle của gà tây con sau khi sử dụng vacxin tại các thời ựiểm.
Lấy mẫu ở các thời ựiểm: 7, 14, 21, 28 ngày sau khi sử dụng vacxin ND - IB và sau khi sử dụng vacxin nhũ dầu 14, 30 ngày và cứ sau 1 tháng lấy mẫu kiểm tra 1 lần. Số lượng mẫu: 15 mẫu/1 lần lấy mẫụ
n Thời ựiểm kiểm tra hiệu giá HI (log2) ở gà tây sau khi sử dụng vacxin (ngày tuổi)
15 7 14 21 30 60 Ầ
- Kiểm tra diễn biến kháng thể chủ ựộng bằng phản ứng HỊ Khi hiệu giá kháng thể giảm dưới 3log2 thì sẽ sử dụng vacxin nhắc lại theo hướng dẫn của Mary Young et al. (2002).
* Thắ nghiệm 4: Xác ựịnh ngưỡng kháng thể ựể bảo hộ cho gà tây với bệnh Newcastlẹ
Tiến hành công cường ựộc trên gà tây sau khi tiêm vacxin ND - Emulsion lần 1 ựược 30 ngàỵ Số lượng công cường ựộc là 10 con sử dụng vacxin và 5 con ựối chứng (không ựược sử dụng vacxin, kiểm tra hiệu giá kháng thể Newcastle của lô ựối chứng trước khi công cường ựộc, ựảm bảo không có kháng thể Newcastle). Trước và sau khi công cường ựộc tiến hành kiểm tra hàm lượng kháng thể Newcastle thông qua hiệu giá của phản ứng HỊ Theo dõi triệu chứng, các biểu hiện bất thường khác, bệnh tắch và tỷ lệ bảo hộẦ
2.4.2. Phương pháp sử dụng vacxin và lấy mẫu huyết thanh
* Phương pháp sử dụng vacxin
- Với vacxin ND - IB pha với dung dịch nước pha vacxin kèm theọ Dùng ống nhỏ (ựi kèm vacxin) ựảm bảo 1 liều/giọt (liều qui ựịnh dùng cho gà), nhỏ vào niêm mạc mắt, mũi cho gà tây con.
- Với vacxin Medivac ND - Emulsion sử dụng tiêm dưới da cổ hoặc da cánh cho gà tây ựảm bảo liều chuẩn cho gà là 0,5ml dung dịch vacxin /liềụ
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
- Với gà tây < 1 tháng tuổi, dùng bơm tiêm nhựa vô trùng lấy máu tim (1ml/con).
- Với gà tây > 1 tháng tuổi lấy máu tĩnh mạch cánh (2ml/con).
Sau khi lấy máu vào bơm tiêm nhựa thì bẻ gập kim chốt nắp an toàn, ựể
nghiêng 300 khi máu ựông thì chắt huyết thanh vào ampul rồi ựưa vào bảo quản
2.4.3. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng kháng thể Newcastle
Sử dụng phản ứng HỊ
* Phản ứng HA (Haemegglutination test): ựể xét nghiệm ựịnh tắnh.
Nguyên lý: Virut Newcastle có ựặc tắnh gây ngưng kết hồng cầu gà do Protein HN trên bề mặt của virut có khả năng gắn với thụ thể có trên bề mặt tế bào hồng cầu làm hồng cầu bị gắn kết lại nằm dải thành hình mạng nhện dưới ựáy ống nghiệm, sau ựó men Neuraminidaza cắt ựứt thụ thể hồng cầu làm hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn. Vì vậy, trong giai ựoạn ựầu của phản ứng cho kết quả chắnh xác. Cách tiến hành gồm các bước theo sơ ựồ sau:
Ống nghiệm đC Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nước S.lý 0,9 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Virut Newcastle Hiệu giá 0,1 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 HC gà 1% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ghi chú:đC: đối chứng; HC: Hồng cầu
- Pha loãng virut (pha loãng virut bằng nước muối sinh lý vô trùng) theo các bậc pha loãng:1/2 ,1/4, 1/8, 1/16...
- Nhỏ 0,5ml hồng cầu gà 1% vào tất cả các ống virut ựã pha loãng.
- Ống ựối chứng âm: nhỏ 0,5 ml nước sinh lý, sau ựó nhỏ 0,5 ml hồng cầu gà 1%. Trộn ựều trong 1 phút và ựọc kết quả sau 20 phút, khi ở ống ựối chứng âm hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ.
Phản ứng dương tắnh: hồng cầu bị ngưng kết thành quầng ựỏ rạn nứt ở dưới ựáy lỗ (hiệu giá ngưng kết ựọc ở ống cuối cùng trước ống không ngưng kết).
Phản ứng âm tắnh: hồng cầu không bị ngưng kết mà bị lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ.
Một ựơn vị HA: là ở ựộ pha loãng virut lớn nhất mà tại ựó vẫn xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầụ đây chắnh là hiệu giá ngưng kết.
* Phản ứng HI (Haemagglutination Inhibition test): dùng ựể xác ựịnh hàm lượng kháng thể Newcastlẹ
Nguyên lý: virut Newcastle có ựặc tắnh gây ngưng kết hồng cầu một số loài gia súc, gia cầm. Nếu gặp ựược kháng thể ựặc hiệu tương ứng thì virut bị kháng thể trung hòa, không còn virut ựể tiếp xúc với hồng cầu, hay nói cách khác kháng thể ựã ngăn trở gây ngưng kết hồng cầu của virut. Còn nếu virut không gặp kháng thể ựặc hiệu tương ứng, virut sẽ không bị trung hòa và virut sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhaụ
Trong phản ứng HI người ta dùng 4 ựơn vị ngưng kết ựể tiến hành phản ứng. để phản ứng HI ựược chắnh xác, cần phải pha chắnh xác 4 ựơn vị HẠ Ta có thể kiểm tra xem kháng nguyên ựã pha ựúng cách chưa bằng cách: trên tấm nhựa Microtest plates dùng 4 dãy, mỗi dãy 4 ô, nhỏ vào mỗi ô 0,5ml nước muối sinh lý, sau ựó dùng kháng nguyên ựã pha loãng ở 4 ựơn vị HA nhỏ vào 4 ô ựầu của dãy, mỗi ô 0,5ml kháng nguyên, trộn ựều rồi hút 0,5ml từ ô thứ nhất sang ô thứ 2, trộn ựều rồi hút 0,2 ml từ ô thứ 2 sang ô thứ 3, trộn ựều rồi hút bỏ 0,5ml. Ta có thứ tự hiệu giá các ô sẽ là: ô thứ nhất có 2 ựơn vị HA, ô thứ 2 có 1 ựơn vị HA, ô thứ 3 có 0,5 ựơn vị HẠ Sau ựó ta nhỏ 0,5ml huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các ô, ô thứ 4 làm ựối chứng chỉ có nước sinh lý (0,5ml) và hồng cầu gà (0,5ml).
Lắc nhẹ tấm nhựa ựể 20 phút, sau ựó ựọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết xảy ra ựến ô thứ 2 thì kháng nguyên ựã pha ựúng.
Phản ứng gồm các bước, theo sơ ựồ sau:
đC Ô giếng (+) (-) Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nước SL (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 HT gà tây (ộl) Hiệu giá 25 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Vắc xin Newcastle 4HA (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 HC gà 1% (ộl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
- Pha loãng huyết thanh ở các ựộ pha loãng 1/2, 1/4 ,1/8, 1/16 ... bằng cách cho 25ộl nước sinh lý vào mỗi ô, nhỏ vào ô thứ nhất 25ộl huyết thanh gà tây, trộn ựều rồi hút lấy 25ộl chuyển sang ô thứ 2. Tiếp tục trộn ựều rồi lại hút 25ộl chuyển sang ô thứ 3, cứ tiếp tục như vậy ựến ô thứ 10 thì hút bỏ ựi 25ộl.
- Cho vào mỗi ô phản ứng 25ộl kháng nguyên virut Newcastle có chứa 4 ựơn vị HẠ
- Lắc nhẹ, ựể khay phản ứng ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút cho kháng nguyên và kháng thể (nếu có) kết hợp với nhaụ
- Cuối cùng cho vào tất cả các ô mỗi ô 50ộl dung dịch hồng cầu gà 1%. - Làm ô ựối chứng:
+ đối chứng âm: cho 25ộl nước sinh lý, 25ộl dung dịch virut Newcastle (4HA) và 50ộl huyễn dịch hồng cầu gà 1%.
+ đối chứng dương: cho 50ộl nước sinh lý, 50ộl hồng cầu gà 1%.
Lắc nhẹ ựể ở nhiệt ựộ phòng và ựọc kết quả sau 20 phút. Khi lỗ ựối chứng dương hồng cầu lắng xuống ựáy lỗ thành cục tròn thì ựọc kết quả.
Phản ứng dương tắnh: hồng cầu lắng xuống ựáy lỗ thành cục tròn. Phản ứng âm tắnh: hồng cầu bị ngưng kết nằm dải ựều ở ựáy lỗ.
Hiệu giá HI ựược tắnh ở ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở ựó vẫn còn có khả năng ức chế sự ngưng kết hồng cầụ
2.4.4. Phương pháp xác ựịnh ngưỡng kháng thể ựể bảo hộ cho gà tây với bệnh Newcastle Newcastle
Dùng phương pháp công cường ựộc. Tiến hành tại Trung tâm chẩn ựoán thú y Trung ương - Cục thú ỵ
- Sử dụng virut Newcastle cường ựộc chủng VN91 tiêm dưới da với liều 100 LD50/1 gà. Theo dõi các biểu hiện triệu chứng và bệnh tắch, hàm lượng kháng thể trước và sau khi công cường ựộc.
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập ựược ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel và Minitab.
- Công thức tắnh hiệu giá kháng thể trung bình (GMT - Geomotric Mean Titers): GMT = (T1 ừ T2 ừẦ..Tn )1/n (*)
Trong ựó : T1 , T2 ,Ầ..Tn : Hiệu giá kháng thể của từng mẫu huyết thanh.
n : Tổng số mẫụ Lấy logarit 2 vế của (*) ta có :
Log2 GMT = Log2 (T1 ừ T2 ừẦ..Tn )1/n = A=> GMT = 2A hoặc GMT =
A log2
- Công thức tắnh tỷ lệ bảo hộ của vacxin : Số mẫu ựạt HLKT bảo hộ
Tỷ lệ bảo hộ(%) = X 100
CHƯƠNG IIỊ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Miễn dịch chống bệnh Newcastle ở gia cầm cũng giống như miễn dịch chống một số bệnh truyền nhiễm khác gồm có miễn dịch thu ựược chủ ựộng ựược tạo ra khi ta tiêm vacxin ựóng vai trò thiết yếu và miễn dịch tiếp thu bị ựộng từ con mẹ truyền cho con con .
Ở gia cầm nói chung, khi cơ thể mẹ có miễn dịch sẽ truyền kháng thể ựặc hiệu cho con non qua lòng ựỏ trứng, ựây là kháng thể thụ ựộng ựược truyền từ mẹ có miễn dịch cho con qua lòng ựỏ trứng (Heller et al., 1977). Lượng kháng thể thụ ựộng tuy chỉ tồn tại trong cơ thể gà con một thời gian nhưng có khả năng bảo hộ cho gà trong những ngày tuổi ựầụ Tuy nhiên, khi dùng vacxin lần ựầu tạo miễn dịch chủ ựộng cho ựàn gà, kháng thể thụ ựộng sẽ trung hòa một lượng virut vacxin (Alexander, 1991). Chắnh ựiều này ựã làm giảm lượng kháng thể Newcastle ựược sản sinh ra (Ahmad and Sharma, 1992).
Vì vậy, việc theo dõi diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ựộng ở ựàn gà tây con có vai trò quan trọng trong việc xác ựịnh ựược thời ựiểm sử dụng liều vacxin ựầu tiên, ựể quyết ựịnh một lịch trình sử dụng vacxin thắch hợp, ựảm bảo an toàn dịch bệnh cho ựàn gà tây, tránh hiện tượng bị hụt hẫng kháng thể trong một khoảng thời gian khi kháng thể thụ ựộng mất ựi nhưng kháng thể bản thân lại chưa có ựược.
Cũng giống như nhiều bệnh khác, ựể sử dụng vacxin phòng bệnh Newcastle cho ựàn gà tây ựạt hiệu quả cao thì việc xác ựịnh hàm lượng kháng thể chủ ựộng trên ựàn gà tây mẹ và hàm lượng kháng thể thụ ựộng ở ựàn con là một việc làm cần thiết. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể Newcastle chủ ựộng của gà tây mẹ với kháng thể thụ ựộng ở gà tây con và diễn biến kháng thể thụ ựộng của gà tây con.
3.1. Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể Newcastle chủ ựộng ở gà tây mẹ và thụ ựộng ở gà tây con Newcastle chủ ựộng ở gà tây mẹ và thụ ựộng ở gà tây con
Việc xác ựịnh mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể có trong cơ thể gà tây mẹ với hàm lượng kháng thể thụ ựộng ở gà tây con thực sự cần thiết vì nó là cơ sở khoa học ựể từ ựó xây dựng ựược lịch phòng bệnh Newcastle cho ựàn gà tây nuôi sinh sản.
Về mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể Newcastle của mẹ và kháng thể thụ ựộng của con, tác giả Trần Thị Lan Hương (2001) khi nghiên cứu trên gà cho biết: Hàm lượng kháng thể Newcastle của gà mẹ và hàm lượng kháng thể thụ ựộng ở gà con 01 ngày tuổi có mối tương quan chặt chẽ và ựồng biến.
Chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm lượng kháng thể của ựàn gà tây mẹ ở các thời ựiểm sau khi tiêm vacxin ND Ờ Emulsion (vacxin Newcastle nhũ dầu) 1,2,3,4,5,6,7 tháng, ựây cũng là thời gian gà tây mẹ ựang ựẻ pha Ị
Chúng tôi tiến hành lấy máu gà tây mẹ làm phản ứng HI ựể kiểm tra hàm lượng kháng thể Newcastlẹ Trứng của chúng ựẻ ra ở các thời ựiểm trên ựược ựánh dấu, ấp nở và kiểm tra hàm lượng kháng thể thụ ựộng ở những gà tây con này lúc 1 ngày tuổi bằng phản ứng HỊ Kết quả ựược trình bày ở bảng 3.1.
Qua khảo sát hàm lượng kháng thể trên ựàn gà tây mẹ ở các thời ựiểm 1,2,3,4,5,6,7 tháng sau khi tiêm vacxin Newcastle nhũ dầu, chúng tôi thấy hàm lượng kháng thể giảm dần sau các thời ựiểm kiểm tra biểu hiện qua hiệu giá của phản ứng HỊ Ở thời ựiểm 1 tháng sau khi tiêm vacxin, hiệu giá HI ựạt cao nhất (7,2log2), sau ựó giảm dần ở các thời ựiểm kiểm tra tiếp theo lần lượt ựạt 6,8log2, 6,4log2; 6,2log2; 5,8log2; 5,6log2 và 4,9log2. Tuy nhiên tỷ lệ bảo hộ của vacxin với bệnh Newcastle ở ựàn gà tây mẹ tại các thời ựiểm kiểm tra vẫn ựạt 100%.
Bảng 3.1. Tương quan giữa hàm lượng kháng thể Newcastle chủ ựộng ở gà tây mẹ và kháng thể thụ ựộng ở gà tây con (01 ngày tuổi)
Thời gian sau khi tiêm vacxin (tháng) đối tượng nghiên cứu (Gà tây) Số mẫu kiểm tra Hiệu giá HI bình quân (X ổ mx) Số mẫu có kháng thể (%) HI ≥ 3log2 (%) Mẹ 10 7,2 ổ 0,51 100 100 1 Con 10 6,1 ổ 0,50 100 100 Mẹ 10 6,8 ổ 0,53 100 100 2 Con 10 5,8 ổ 0,49 100 100 Mẹ 10 6,4 ổ 0,50 100 100 3 Con 10 5,5 ổ 0,50 100 100 Mẹ 10 6,2 ổ 0,49 100 100 4 Con 10 5,3 ổ 0,47 100 100 Mẹ 10 5,8 ổ 0,47 100 100 5 Con 10 4,9 ổ 0,48 100 100 Mẹ 10 5,6 ổ 0,43 100 100 6 Con 10 4,3 ổ 0,37 100 100 Mẹ 10 4,9 ổ 0,46 100 100 7 Con 10 3,7 ổ 0,26 100 100
Trên các ựàn gà tây con nở ra từ trứng của gà tây mẹ ở các thời ựiểm khảo sát, hàm lượng kháng thể thụ ựộng lúc 1 ngày tuổi cũng giảm dần tương ứng với sự giảm lượng kháng thể của gà tây mẹ, cụ thể: tại thời ựiểm 1 tháng sau khi tiêm vacxin, hàm lượng kháng thể Newcastle trong máu của gà tây mẹ ựạt cao nhất khi ựó lượng kháng thể thụ ựộng của gà tây con 1 ngày tuổi nở từ trứng của mẹ tại thời ựiểm này cũng ựạt cao nhất , hiệu giá HI bình quân ựạt 6,1log2. Các ựàn gà tây con nở ra từ trứng của những gà mẹ sau khi sử dụng vacxin Newcastle nhũ dầu 2,3,4,5,6,7 có hàm lượng kháng thể Newcastle trong máu giảm dần và lần lượt là 5,8log2; 5,5log2; 5,3log2; 4,9log2; 4,3log2 và 3,7log2, tỷ lệ bảo hộ của vacxin ựối với bệnh ở các ựàn con kiểm tra ựều ựạt 100%.
để làm rõ hơn mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể gà tây mẹ (x) và gà tây con (y), chúng tôi tắnh hệ số tượng quan (r), kết quả r = 0,985; phương