Chiết là phương pháp dùng dung môi để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Trong đề tài này sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm. Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu lá cây.
Ngâm nguyên liệu trong một bình chứa thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, có nắp đậy. Rót dung môi vào bình cho đến ngập bề mặt của nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng để dung môi xuyên thấu vào cấu trúc tế bào thực vật, hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, lọc dung dịch chiết qua giấy lọc thu được dịch chiết, đem chưng cất chân không dưới áp suất kém thu được cao chiết. Rót tiếp dung môi vào bình chứa nguyên liệu, chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu.
2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Sắc kí là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh.
24
2.2.2.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG
Sắc ký bản mỏng hay còn được gọi là sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như: silicagel hoặc oxit alumin.
Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, nhôm hoặc plastic.
Bình sắc ký là chậu, hũ, lọ,...bằng thủy tinh, có nắp đậy để bão hòa hơi hệ dung môi. Pha tĩnh là một lớp silica gel mỏng khoảng 25 nm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng.
Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác
nhau. Sử dụng khoảng 1 l dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản
để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
2.2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu.
Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn (hạt rắn nhuyễn, mịn, có tính trơ). Ở phương pháp này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của pha tĩnh. Các chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển qua pha tĩnh, chúng sẽ tách nhau ra.
Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất
25
rất phân cực. Trong sắc ký cột hấp thu, pha rắn thường là những hạt silica gel có mang nhiều nhóm –OH trên bề mặt nên đây là pha tĩnh có tính rất phân cực.
2.2.3 PHƯƠNG PHÁP PHỔ
Sử dụng phương pháp phổ để có thể xác định cấu trúc của một hợp chất hữu cơ.
2.2.3.1 PHỔ 1H-NMR
Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1H-
NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin – spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó.
2.2.3.2 PHỔ 13C-NMR
Cho thông tin về khung carbon của phân tử. Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất
hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 – 250 ppm) (có thể đến 600 ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa
học của carbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của
carbon đó.
Phổ 13C-NMR DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời cả 2
phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Kỹ thuật này cho các tín hiệu carbon gắn với 1 ,2 hoặc 3
hydro.
2.2.3.3 PHỔ HSQC VÀ HMBC
Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C.
Phổ HSQC cho tín hiệu của carbon gắn trực tiếp vào proton, nghĩa là tương tác ngang qua 1 nối hóa trị.
Phổ HMBC cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị.
2.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM NGUYÊN LIỆU
Lấy 100g lá ô môi tươi, làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50- 60oC đến khối
26
Cân lại và tính độ ẩm theo công thức sau:
Trong đó: A : độ ẩm (%)
mt : lượng cân mẫu tươi (g)
mk : lượng cân mẫu khô (g)
Kết quả tính độ ẩm là cơ sở lựa chọn phương pháp ly trích, chiết tách, lập và tính hiệu suất các quá trình.
Sau 3 lần thực hiện, kết quả được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Độ ẩm lá ô môi
Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng mẫu khô (g) 16,30 16,40 16,45
Trung bình (g) 16,38
Độ ẩm A (%) 83,62
Vậy độ ẩm lá ô môi nguyên liệu là 83,62%.