2.1.1 NGUYÊN LIỆU
2.1.1.1 THU HÁI NGUYÊN LIỆU
Mẫu lá ô môi được thu hái ở huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Thời gian thu hái: tháng 11/2012.
2.1.1.2 XỬ LÝ MẪU NGUYÊN LIỆU
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, sau đó sấy lại ở nhiệt độ
50 - 600C. Lá ô môi sau khi sấy khô được vò nát thành bột nhuyễn.
Đây là nguyên liệu dùng trong đề tài.
Hình 2.1: Lá ô môi khô và bột lá ô môi
2.1.2 HÓA CHẤT - Ethanol 960 - Ethanol 960 - n-Hexan - Ethyl acetate - Methanol - Chloroform - Na2SO4 khan - H2SO4 đđ - Các thuốc thử định tính
23 2.1.3 THIẾT BỊ
-Becher các loại -Bình ngâm mẫu -Bình sắc ký
-Erlen các loại -Giá ống nghiệm -Bình phun xịt thuốc thử
-Ống đong các loại -Pipette Pasteur -Máy sấy, tủ sấy, tủ hút
-Lọ thủy tinh 50ml -Pipette nhựa -Máy cô quay chân không
-Đũa thủy tinh -Giấy lọc, túi vải -Bình cô quay các loại
-Phễu thủy tinh -Nồi đun cách thủy -Cân phân tích GR-200
-Vi quản -Bếp điện -Cân kỹ thuật GM 612
-Ống nghiệm -Lưới amiăng -Cột sắc ký các loại
-Bình long -Muỗng nhựa, inox -Bản silica gel 60 F254
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU[6, 7]
2.2.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
Chiết là phương pháp dùng dung môi để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Trong đề tài này sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm. Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu lá cây.
Ngâm nguyên liệu trong một bình chứa thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, có nắp đậy. Rót dung môi vào bình cho đến ngập bề mặt của nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng để dung môi xuyên thấu vào cấu trúc tế bào thực vật, hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, lọc dung dịch chiết qua giấy lọc thu được dịch chiết, đem chưng cất chân không dưới áp suất kém thu được cao chiết. Rót tiếp dung môi vào bình chứa nguyên liệu, chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu.
2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Sắc kí là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh.
24
2.2.2.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG
Sắc ký bản mỏng hay còn được gọi là sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như: silicagel hoặc oxit alumin.
Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, nhôm hoặc plastic.
Bình sắc ký là chậu, hũ, lọ,...bằng thủy tinh, có nắp đậy để bão hòa hơi hệ dung môi. Pha tĩnh là một lớp silica gel mỏng khoảng 25 nm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng.
Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác
nhau. Sử dụng khoảng 1 l dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản
để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
2.2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu.
Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn (hạt rắn nhuyễn, mịn, có tính trơ). Ở phương pháp này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của pha tĩnh. Các chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển qua pha tĩnh, chúng sẽ tách nhau ra.
Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất
25
rất phân cực. Trong sắc ký cột hấp thu, pha rắn thường là những hạt silica gel có mang nhiều nhóm –OH trên bề mặt nên đây là pha tĩnh có tính rất phân cực.
2.2.3 PHƯƠNG PHÁP PHỔ
Sử dụng phương pháp phổ để có thể xác định cấu trúc của một hợp chất hữu cơ.
2.2.3.1 PHỔ 1H-NMR
Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1H-
NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin – spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó.
2.2.3.2 PHỔ 13C-NMR
Cho thông tin về khung carbon của phân tử. Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất
hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 – 250 ppm) (có thể đến 600 ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa
học của carbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của
carbon đó.
Phổ 13C-NMR DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời cả 2
phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Kỹ thuật này cho các tín hiệu carbon gắn với 1 ,2 hoặc 3
hydro.
2.2.3.3 PHỔ HSQC VÀ HMBC
Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C.
Phổ HSQC cho tín hiệu của carbon gắn trực tiếp vào proton, nghĩa là tương tác ngang qua 1 nối hóa trị.
Phổ HMBC cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị.
2.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM NGUYÊN LIỆU
Lấy 100g lá ô môi tươi, làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50- 60oC đến khối
26
Cân lại và tính độ ẩm theo công thức sau:
Trong đó: A : độ ẩm (%)
mt : lượng cân mẫu tươi (g)
mk : lượng cân mẫu khô (g)
Kết quả tính độ ẩm là cơ sở lựa chọn phương pháp ly trích, chiết tách, lập và tính hiệu suất các quá trình.
Sau 3 lần thực hiện, kết quả được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Độ ẩm lá ô môi
Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng mẫu khô (g) 16,30 16,40 16,45
Trung bình (g) 16,38
Độ ẩm A (%) 83,62
Vậy độ ẩm lá ô môi nguyên liệu là 83,62%.
2.3 ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ Ô MÔI[7]
2.3.1 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT ALCALOID
Cân 5g bột khô ngâm với 80ml HCl 1% trong 4-6 giờ. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thửnBouchardat: 2,5g I2, 5g KI, 10ml H2O.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, nghiêng ống nghiệm và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1ml các thuốc thử theo thành ống nghiệm, lắc đều, để yên và quan sát.
Thuốc thử Bouchardat: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm là dương tính. (%) t k .100 t m m A m
27
2.3.2 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT COUMARINE
Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50ml EtOH 95% trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử: 0,5ml dung dịch NaOH 10%, vài giọt HCl đđ, 12ml H2O, 2ml dung
dịch Na2CO3 10%.
Tiến hành:
- Phản ứng mở vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử,
thêm vào 1 trong 2 ống 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp
cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml H2O. Nếu chất lỏng
trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Tiếp
tục đem acid hóa ống có kiềm với vài giọt HClđđ, nếu dung dịch đang trong
suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính.
- Phản ứng diazo hóa: Lấy 2ml mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung
dịch Na2CO3 10% và 4ml H2O. Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ
thẫm là dương tính.
2.3.3 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID
Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50ml EtOH 95% trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử: HCl đđ + bột Mg + alcol isoamylic, dung dịch (CH3COO)2Pb bão
hòa, dung dịch FeCl3 1%.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ, sau đó cho
một ít bột Mg vào và lắc đều. Thêm từ từ từng giọt alcol isoamylic, để yên quan sát nếu thấy xuất hiện vòng màu hồng hay dung dịch có màu tím thì có flavonoid trong mẫu.
Dung dịch mẫu tạo kết tủa màu xanh lục đen với dung dịch FeCl3 1%, kết tủa
trắng với dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa.
2.3.4 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT GLYCOSYDE
Lấy 10g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE. Tiếp theo chiết với EtOH
28
hiện. Sau đó loại (CH3COO)2Pb dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao
glycosyde thô. Hòa tan cao này bằng EtOH 90% và lấy dung dịch này làm mẫu thử. Thuốc thử:
- Tollens: 1ml dung dịch AgNO3 10% + 1ml dung dịch NaOH 10% + từ từ
từng giọt dung dịch NH4OH 25%.
Fehling: Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch sau lại với nhau.
Dung dịch A: 40g CuSO4.5H2O + H2O, định mức vừa đủ 1 lít.
Dung dịch B: 200g KNaC4H4O6.4H2O + 150g NaOH + H2O, định mức vừa
đủ 1 lít.
Tiến hành: Lấy 1ml mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1ml các thuốc thử.
- Thuốc thử Tollens: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu bạc là dấu hiệu dương
tính.
- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút. Nếu
thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ là dương tính.
2.3.5 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT SAPONIN DỰA VÀO CHỈ SỐ TẠO BỌT DỰA VÀO CHỈ SỐ TẠO BỌT
Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định.
Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục đun cho nước trong erlen sôi trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5,..., 10ml dịch lọc. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao các cột bọt.
Chỉ số bọt được tính theo công thức:
CSB = 100.(10/i)
Trong đó: CSB: Chỉ số tạo bọt.
29
Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin.
2.3.6 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT STEROID
Cân 1g bột khô, cho vào 20ml CHCl3 và ngâm trong 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch
trong là mẫu thử. Thuốc thử:
- Salkowsky: 1ml H2SO4 đđ
- Libermann-Burchard: 20ml (CH3CO)2O, 1ml H2SO4 đđ
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1ml các thuốc thử theo thành ống nghiệm. Để yên, quan sát.
- Thuốc thử Salkowsky: Nếu dung dịch có màu đỏ đến nâu đỏ là dương tính.
- Thuốc thử Libermann-Burchard: Nếu thấy xuất hiện một vòng ngăn cách
giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá là dương tính.
2.3.7 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC HỢP CHẤT TANIN
Cân 5g bột khô, đun sôi với 100ml nước cất trong 10 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử. Thuốc thử:
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Pha đến bão hòa trong nước.
- Dung dịch FeCl3: Pha nồng độ 1% trong nước.
Tiến hành: Lấy 2ml dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử.
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt là dấu
hiệu dương tính.
- Dung dịch FeCl3: Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen
30 2.3.8 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH
Kết quả định tính được tổng hợp và trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong lá ô môi
STT HỢP CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG KẾT
LUẬN
1 ALCALOID Bouchardat Kết tủa nâu ++
2 COUMARINE
Phản ứng mở vòng lacton Không có hiện tượng -
Phản ứng diazo hóa Không có hiện tượng -
3 FLAVONOID
FeCl3 Kết tủa xanh lục ++
(CH3COO)2Pb Kết tủa trắng ++
4 GLYCOSYDE
Tollens Kết tủa màu bạc ++
Fehling Kết tủa đỏ +
5 SAPONIN Tạo bọt CSB > 100 ++
6 STEROID
Salkowsky Dung dịch nâu đỏ ++
Libermann-Burchard Vòng màu xanh ++
7 TANIN
(CH3COO)2Pb Kết tủa vàng nhạt +++
FeCl3 Dung dịch xanh đen +++
Chú thích:
- : Âm tính
+ : Dương tính
++ : Dương tính rõ
+++ : Dương tính rất rõ
Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học hữu cơ, trong lá ô môi có sự hiện diện của các hợp chất: steroid, flavonoid, alcaloid, saponin, tanin, glycosyde.
31
Các thành phần khác như: acid hữu cơ, carotenoid...vẫn chưa được khảo sát.
Phần hình ảnh định tính được trình bày ở phần Phụ lục 1: Hình ảnh định tính
32 2.4 CÔ LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO THÔ
2.4.1 ĐIỀU CHẾ CÁC CAO THÔ
Bột lá ô môi (7.6 kg) được trích với 30 lít ethanol 960 bằng phương pháp ngâm
dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOH dạng sệt có khối lượng 1200g.
Đem cao EtOH chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc.
Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với 25 lít n-Hexan đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao n-Hexan có khối lượng 609g.
Phần không tan trong n-hexan tiếp tục được chiết với 20 lít EtOAc. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết, đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOAc có khối lượng 279g.
Hình 2.2: Ngâm dầm Hình 2.3: Lọc
33
Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các cao thô từ lá ô môi
- Trong luận văn này chúng tôi chỉ khảo sát cao EtOAc.
Cao EtOH 960 (1200 g)
- Chiết với n-Hexan - Cô cạn dung môi
Sấy ở 50-600C, vò nát
- Chiết 7.6 kg bột khô với etanol 960
- Cô cạn dung môi
Bột khô (8,6 kg) Mẫu lá ô môi tươi Khảo sát định tính sơ bộ thành phần hóa học Xác định độ ẩm nguyên liệu
- Chiết với EtOAc - Cô cạn dung môi
- Sắc ký cột
- Sắc ký bản mỏng - Kết tinh lại - Rửa kết tủa
Xác định cấu trúc hóa học, nhận danh. Sản phẩm
Cao EtOAc ( 279 g) Phần
không tan trong EtOAc Cao n-hexan (609 g) Phần không tan trong n-Hexan
34
2.4.2 CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE ACETATE
2.4.3 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE
Tiến hành sắc ký cột cổ điển. Các thông số cột:
600g silica gel 230 – 400 mesh Kích thước cột 90 x 600 (mm x mm) Khối lượng mẫu 279g
Hệ dung môi giải ly: n-Hexan – EtOAc (H : E) với các tỉ lệ thay đổi theo hướng tăng dần độ phân cực (từ H:E = 75:25 đến 100% EtOAc…).
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng (TLC), hiện vết bằng cách