2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là
:
LOD = 3.SD
B (2.1) Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lƣợng (LOQ)
LOQ
đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:
LOQ = 10.SD
B (2.2)
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp
- , CPM và
PNH tự pha chế thông qua sai số tương đ
: Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C (2.3) Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.
CTinh toan (µg/mL) .
C0 (µg/mL) , CPM và PNH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Đánh giá độ đúng của phươn
: Re = C - T .100% a a C v (2.4) Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL) xác
định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn; Ca: nồng độ (
.
a: nồng độ ( thêm vào mẫu
(đã biết). - (RSD). n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C (2.5) RSD = .100(%) C S (2.6) Trong đó: Ci (µg/mL) PNH tính được lần thứ i;
là giá trị nồng độ thực của mẫu;
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do.
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:
P,k
t .S X ± ε = X ±
n (2.7)
Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ); X
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.5); n là số phép đo.
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.4.1. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-VIS
- – Đại học Thái Nguyên.
- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu
– Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Bếp cách thủy.
- Máy rung siêu âm. - Máy đo pH.
2.4.2. Dụng cụ
- Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL.
- Bình định mức dung dịch: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500 mL; 1000 mL.
- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [22]. - Một số dụng cụ khác.
2.4.3. Hóa chất
- HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4, Na2HPO4, CH3CN... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
- Chất chuẩn paracetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
- Thuốc viên TIFFY sản xuất bởi công ty TNHH NACORN PATANA Tuy Hòa – Phú Yên - Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.4. Chế phẩm TIFFY
Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Paracetamol : 500 mg
Clopheninamin maleat: 2mg Phenylephin hydroclorit: 7,5 mg
2.5. Chuẩn bị ẫu
, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau:
- Dung dịch đệm NaH2PO4 0,05M.
- Dung dịch pha loãng (gọi là dung dịch I). - Dung dịch pha mẫu (gọi là dung dịch II). - Dung dịch pha động.
- Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.
- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5. 10-4M. - Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.
Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan 6,4g NaH2PO4 trong 1 lít nước cất 2 lần sau đó lắc siêu âm trong 10 phút. Độ pH của dung dịch được điều chỉnh bằng 4,0 với axit photphoric thu được hỗn hợp đệm 0,05M.
Dung dịch pha loãng (dung dịch I) được pha bằng cách lấy đệm NaH2PO4 0,05M và acetonitrile với tỷ lệ về thể tích là 1:1.
Dung dịch pha mẫu (dung dịch II) là hỗn hợp nước cất và dung dịch pha loãng với tỉ lệ về thể tích là 24 : 1.
Dung dịch pha động chuẩn bị bằng cách lấy đệm NaH2PO4 0,05M và acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích từ 85:15 đến 95:5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
0,001M.
Lấy 5,5 mL dung dịch H2SO4 97% nh 100 mL thu được dung dịch H2SO4
H2SO4 0,05M; H2SO4 2SO4 0,0005M. Lấy 7 mL dung dịch HNO3
100 mL thu được dung dịch HNO3 3
0,1M; 0,001M..
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phƣơng pháp HPLC
3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 3 chất PRC, CPM và PNH
Qua việc nghiên cứu tính chất lý hóa của 3 chất PRC, CPM và PNH kết hợp với tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), sử dụng cột silica C18, thể tích bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ 30o
C.
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động
Để chọn được pha động thích hợp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỉ lệ thành phần pha động là hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05M : acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích lần lượt là: 85:15 cho đến 95:5 với tốc độ dòng là 1,5 mL/phút. Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm sau đó rung siêu âm để khử bọt khí.
Sự thay đổi tỉ lệ thành phần pha động làm thay đổi đáng kể kết quả sắc ký. Tuy nhiên tỷ lệ hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05M : acetonitrile 93:7 cho kết quả tốt nhất với thời gian lưu của PRC là 8,62 giây; CPM là 2,78 giây và PNH là 3,27 giây.
Vì vậy, chúng tôi chọn pha động để xác định đồng thời 3 chất là hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05M : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7.
3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng
Việc lựa chọn bước sóng dựa trên cơ sở các tài liệu tham khảo kết hợp với khảo sát thực nghiệm tại 2 bước sóng λ = 280 nm và λ = 215 nm.
Tại λ = 280 nm: là bước sóng tại đó PRC có độ hấp thụ quang cực tiểu CPM và PNH có độ hấp thụ quang trung bình. Tuy nhiên kết quả thực nghiệm cho thấy các pic của CPM và PNH hầu như không xuất hiện.
Tại λ = 215 nm: là bước sóng PRC có độ hấp thụ quang cực tiểu, CPM và PNH có độ hấp thụ quang cao. Kết quả thực nghiệm cho thấy đường nền thẳng, xuất hiện cả 3 pic với thời gian lưu phù hợp. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.1, 3.2, 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.1. phổ pic của PRC (500 µg/mL)
Hình 3.2. phổ pic của CPM (8 µg/mL)
Hình 3.3. phổ pic của PNH (20 µg/mL)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Để lựa chọn được tốc độ dòng thích hợp, chúng tôi tiến hành sắc ký với các điều kiện ở trên nhưng với các tốc độ dòng là 1 mL/phút, 1,5 mL/phút và 2 mL/phút.
Với tốc độ dòng 1 mL/phút, đỉnh của các pic bị tù và chân pic bị dãn. Với tốc độ dòng 1,5 mL/phút, kết quả tách tốt, các pic tách rời nhau và thời gian chạy sắc ký phù hợp.
Với tốc độ dòng 2 mL/phút, các pic có đỉnh nhọn và chân pic hẹp.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tốc dộ dòng là 1,5 mL/phút để tiến hành phân tích sắc ký.
Kết luận chung: Từ các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu
cho phương pháp xác định đồng thời PRC, CPM và PNH là:
Pha động: hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05M : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7. Detector UV-VIS: λ = 215 nm. Cột: sử dụng cột C18 (250mm x 4,6). Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút. Thể tích bơm mẫu: 20 µL. Nhiệt độ phân tích: 30o C.
Với các điều kiện trên, chúng tôi đã tiến hành phân tích và kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 3.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả phổ ở hình 3.4 cho thấy 3 pic đều được tách ra hoàn toàn, các pic gọn và cân đối, thời gian lưu của 3 chất là hợp lý với thời gian lưu của PRC là 8,62 phút, CPM là 2,78 phút và PNH là 3,27 phút.
3.1.2. Đánh giá phƣơng pháp định lƣợng
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn
Dung dịch PRC 1: Cân chính xác 50 mg PRC cho vào bình định mức 50 mL và định mức bằng dung dịch II, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút. Thu được dung dịch PRC có nồng độ là 1000 µg/mL (gọi là dung dịch PRC 1). Pha loãng dung dịch PRC 1 bằng dung dịch II thu được các dung dịch PRC có nồng độ 800 µg/mL, 600 µg/mL, 400 µg/mL và 200 µg/mL.
Dung dịch CPM 1: Cân chính xác 50 mg CPM cho vào bình định mức 100 mL và định mức bằng dung dịch II, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút thu được dung dịch CPM có nồng độ 500 µg/mL. Pha loãng bằng dung dịch II thu được dung dịch CPM có nồng độ là 25 µg/mL (gọi là dung dịch CPM 1).Tiếp tục pha loãng dung dịch CPM 1 bằng dung dịch II thu được các dung dịch CPM có nồng độ 8 µg/mL, 4 µg/mL, 2 µg/mL và 1 µg/mL.
Dung dịch PNH 1: Cân chính xác 50 mg PNH cho vào bình định mức 100 mL và định mức bằng dung dịch II sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút thu được dung dịch PNH có nồng độ 500 µg/mL. Pha loãng bằng dung dịch II thu được dung dịch PNH có nồng độ là 25 µg/mL (gọi là dung dịch PNH 1). Pha loãng dung dịch PNH 1 bằng dung dịch II thu được các dung dịch PNH có nồng độ 20 µg/mL, 15 µg/mL, 8 µg/mL, 5 µg/mL.
Dung dịch chuẩn: lấy lần lượt 12,5 mL dung dịch PRC 1; 2 mL dung dịch CPM 1 và 7,5 mL dung dịch PNH 1 cho vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch II được dung dịch chuẩn có nồng độ: PRC : CPM : PNH = 500 : 2 : 7,5 (µg/mL).
Các dung dịch được lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm.
3.1.2.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống.
Để khảo sát tính thích hợp của hệ thống máy HPLC khi phân tích định lượng PRC, CPM và PNH. Chúng tôi tiến hành khảo sát các đại lượng đặc trưng như: số đĩa lý thuyết, độ phân giải, thời gian lưu, diện tích pic qua việc bơm lặp lại 4 lần dung dịch chuẩn để sắc ký. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.1; 3.2 và 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Giá trị các đại lượng đặc trưng
Hoá chất Số đĩa lý thuyết ( N ) Độ phân giải ( RS )
CPM 3091
2,18
PNH 2737
12,59
PRC 3302
Kết quả ở bảng 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy: các thông số hệ thống như số đĩa lý thuyết và độ phân giải nằm trong giới hạn cho phép. Chỉ số %RSD của diện tích pic và thời gian lưu được tìm thấy đều nhỏ hơn 2%. Vì vậy hệ thống sắc ký đảm bảo tính thích hợp với cả 3 chất phân tích.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lưu
Lần bơm PRC CPM PNH Thời gian lưu (phút) Số liệu thống kê Thời gian lưu (phút) Số liệu thống kê Thời gian lưu (phút) Số liệu thống kê 1 8,620 X = 8,620 S = 0,001 %RSD=0,01 2,783 X = 2,783 S = 0,0006 %RSD= 0,02 3,267 X = 3,268 S = 0,001 %RSD= 0,03 2 8,619 2,782 3,269 3 8,621 2,782 3,267 4 8,620 2,783 3,268
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic
Lần bơm PRC CPM PNH Diện tích pic Số liệu thống kê Diện tích pic Số liệu thống kê Diện tích pic Số liệu thống kê 1 4608,9 X = 4613,1 S = 14,98 %RSD = 0,32 275,6 X = 274,9 S = 2,49 %RSD = 0,91 837,8 X = 831,6 S = 8,16 %RSD = 0,98 2 4635,1 272,1 825,3 3 4601,6 277,9 839,5 4 4606,8 273,8 823,9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ khác nhau:
Các dung dịch PRC có nồng độ từ 200 - 800 µg/mL, CPM có nồng độ từ 1 - 8 µg/mL và PNH có nồng độ từ 5 - 20 µg/mL được pha loãng từ dung dịch PRC 1, CPM 1 và PNH 1 bằng dung dịch II như ở mục 3.1.2.1.
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2
.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 3 chất được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC, CPM và PNH
PRC
Dung dịch 1 2 3 4
Nồng độ (µg/mL) 200 400 600 800
Diện tích (mAuxphút) 1723,49 3765,98 5622,46 7416,95 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 9,4684x -102 với R2
= 0,9991
CPM
Dung dịch 1 2 3 4
Nồng độ (µg/mL) 1 2 4 8
Diện tích (mAuxphút) 137,94 275,89 541,78 1109,56 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 138,75x – 4,003 với R2
= 0,9998
PNH
Dung dịch 1 2 3 4
Nồng độ (µg/mL) 5 8 15 20
Diện tích (mAuxphút) 556,56 904,89 1674,68 2262,22 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 113,09x -7,4838 với R2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ kết quả ở bảng 3.4. Biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic PRC, CPM và PNH theo nồng độ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.5; 3.6 và 3.7.
y = 9.4684x - 102 R2 = 0.9991 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 200 400 600 800 1000 C(µg/mL) D iệ n tí ch
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC
y = 138.75x - 4.003 R2 = 0.9998 0 200 400 600 800 1000 1200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C(µg/mL) D iệ n tí ch
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CPM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ y = 113.09x - 7.4838 R2 = 0.9998 0 500 1000 1500 2000 2500 0 5 10 15 20 25C(µg/mL) D iệ n t ích
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PNH
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký
Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp với các dung dịch chuẩn PRC 500 µg/mL; CPM 2 µg/mL; PNH 7,5 µg/mL (ở mục 3.2.1) và 4 dung dịch thử như sau: Cân chính xác 20 viên thuốc TIFFY ( X= 0,5725g, mỗi viên có chứa 500 mg PRC; 2 mg CPM và 7,5 mg PNH), sau đó tính khối lượng trung bình của viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác 114,5 mg bột thuốc tương đương với 100 mg PRC; 0,4 mg CPM và 1,5 mg PNH cho vào bình định mức 100 mL sau đó định mức bằng dung dịch II và rung siêu âm trong 15 phút ta được dung dịch chứa PRC 1000 µg/mL; CPM 4 µg/mL và PNH 15 µg/mL. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm. Pha loãng 2 lần dung dịch bằng dung dịch II thu được dung dịch chứa PRC 500 µg/mL; CPM 2 µg/mL và PNH 7,5 µg/mL.
Đo các dung dịch trên trong điều kiện sắc ký đã chọn, so sánh diện tích pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại
Mẫu PRC CPM PNH Diện tích pic (mAuxphút) Hàm lượng (µg/mL) Diện tích pic (mAuxphút) Hàm lượng (µg/mL) Diện tích pic (mAuxphút) Hàm lượng (µg/mL) Chuẩn 4683,72 500 275,89 2,0 848,33 7,5