Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.3. Kết quả thử nghiệm nhân giống bảo tồn tại Cát Bà
4.3.3. Thử nghiệm nhân giống Củ Bình vôi bằng phương pháp Nuôi cấy mô
4.3.3. 1. Kết quả giai đoạn vào mẫu, tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống invitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo đƣợc vật liệu thực vật vô trùng vào nuôi cấy in vitro.
Hình 4.17: Nuôi ấy mô loài Bình vôi trong phòng nghiệm tại Trung tâm Công nghệ Hải Phòng.
(Nguồn ảnh: Nguyễn Văn Dinh, (2016)) Vật liệu sử dụng cho quá trình vào mẫu là đoạn thân mang mắt ngủ dài khoảng 2-3cm của cây Bình vôi. Mẫu cấy được rửa dưới vòi nước chảy, lắc đều
trong dung dịch xà phòng loãng khoảng 1 phút và rửa lại dưới vòi nước chảy. Sau đó, mẫu cấy đƣa vào thao tác trong tủ cấy vô trùng.
Dung dịch khử trùng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là viên khử trùng Preset 5g/l (thành phần của Presep: Natri Dichloroisocyanutrale khan 50%, Adipic Acid 22.5%, các thành phần khác 27,5%) và HgCl2 0,2%.
Mẫu vô trùng được cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 30g/l sucrose, 100mg/l inositol, 6g/l agar
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 4.18: Ảnh hưởng của dung dịch khử trùng đến mẫu cấy (sau 3 tuần) Chỉ tiêu theo
dõi Công thức
Tỷ lệ mẫu sống (%)
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1: Presept (5g/l): 5 phút 65,33 34,67
CT2: Presept (5g/l): 7 phút 83,33 16,67
CT3: HgCl2 0,2 %: 5 phút 75,00 25,00
CT4: HgCl2 0,2 %: 7 phút 50,67 49,33
Kết quả mẫu biểu trên cho thấy:
- Kết quả khử trùng mẫu đạt cao nhất ở CT2 là 83,33% trong 7 phút và tiếp đó là CT3 đạt 75% trong 5 phút. Mức độ sát khuẩn của HgCl2 mạnh hơn so với viên khử trùng Preset
- Tuy nhiên, trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn chất khử trùng là viên khử trùng Preset vì: Thủy ngân là chất độc có khả năng tích lũy và tồn tại dai dẳng gây tác hại kéo dài đối với sức khỏe con người. Viên khử trùng Preset không gây nguy hiểm gì khi tiếp xúc với da và niêm mạc; thời gian duy trì khả năng diệt khuẩn cao của viên khử trùng Preset tương đối ngắn (dưới năm ngày) không gây ảnh hưởng đến mẫu cấy và môi trường nuôi cấy
4.4.3 2. Kết quả giai đoạn tái sinh và nhân nhanh chồi
Sau khi tạo đƣợc nguồn vật liệu khởi đầu, các mẫu cấy đƣợc chuyển sang môi trường có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin là BA để tái sinh và nhân nhanh chồi. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BA là một cytokinin
tổng hợp có tác động kích thích sự phân chia tế bào, phân hoá chồi và kích thích nảy mầm chồi ngủ, tạo nên sự trẻ hoá của các bộ phận và toàn cây, nên đƣợc sử dụng rộng rãi. Trong nhiều trường hợp BA là hợp chất không thể thay thế được trong quá trình nuôi cấy in vitro.
Ở giai đoạn này chúng tôi đã bổ sung BA vào môi trường MS với các nồng độ 0mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l và 0,3mg/l.
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 4.19: Ảnh hưởng của BA đến chất lượng chồi tạo thành và hệ số nhân nhanh của cây Bình vôi (sau 7 tuần )
Chỉ tiêu theo dõi Công thức
Tỷ lệ mẫu tạo chồi
(%)
Hệ số nhân chồi (lần)
Chiều cao TB của chồi
(cm)
CT1 (đ/c) + 0 BA 0,00 0,00 1,51
CT2 + 0,1 mg/l BA 45,21 3,07 2,29
CT3 + 0,2 mg/l BA 87,13 4,13 2,88
CT4 + 0,3 mg/l BA 72,30 3,23 1,24
CV% - - 4,00 2,60
LSD0,05 - - 0,17 0,56
Kết quả bảng 4.19 cho thấy:
- Việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng BA trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và khởi động sự tạo chồi của cây Bình vôi. Khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi từ 45,21-90,13%, cao hơn công thức đối chứng (0%). Tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi đạt cao nhất ở CT3 là 87,13%. Khi tăng nồng độ BA ở CT4 tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi lại có xu hướng giảm, đạt 72,30%
- Chất điều tiết sinh trưởng BA ngoài tác dụng đẩy mạnh sự phân chia tế bào còn có tác dụng kích thích sự tạo nhánh bên. Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi tăng khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy. CT3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là 4,13 lần và chiều cao chồi trung bình đạt 2,88cm. Tuy nhiên, khi bổ sung BA với nồng
độ 0,3mg/l, chỉ tiêu về hệ số nhân và chiều cao chồi giảm; chất lƣợng chồi kém, chồi mảnh, ngắn, lá có màu vàng.
Qua bảng 4.19 có thể thấy, sự sai khác giữa các công thức ở cả hai chỉ tiêu hệ số nhân chồi và chiều cao chồi đều có ý nghĩa ở mức 5%.
4.3.3.3. Kết quả giai đoạn ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Cây giống invitro sẽ hấp thu nước và dinh dưỡng thông qua bộ rễ. Do đó cây giống sẽ sinh trưởng tốt ở vườn ươm nếu có được bộ rễ khỏe. Môi trường ra rễ thường được bổ sung các auxin để thích thích và nâng cao khả năng ra rễ cũng như chất lƣợng rễ. α- NAA là một auxin điển hình và có hiệu quả rất tốt ở nhiều đối tƣợng cây trồng.
Các chồi phát triển bình thường và có chiều cao 3-3,5cm sẽ được tách riêng rẽ và cấy chuyển sang môi trường kích thích ra rễ
Chúng tôi bố trí thí nghiệm với môi trường có bổ sung thêm 0,1 mg/l;
0,2mg/l và 0,3mg/l α- NAA nhằm khảo sát ảnh hưởng của α- NAA đến sự ra rễ của chồi cây Bình vôi
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.20:
Bảng 4.20: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của cây Bình vôi (sau 4 tuần )
Chỉ tiêu theo dõi
Công thức
Tỷ lệ ra rễ (%)
Số rễ TB/cây (cái)
Số lá TB/cây (lá)
Chiều cao TB của cây
(cm)
CT1 (đ/c) + 0 α- NAA 0,00 0,00 1,34 3,85
CT2 + 0,1 mg/l α- NAA 100 5,15 2,95 5,66
CT3 + 0,2 mg/l α- NAA 100 4,35 2,71 5,46
CT4 + 0,3 mg/l α- NAA 100 2,22 3,42 4,83
CV% - - 1,30 3,10 4,30
LSD0,05 - - 0,14 0,24 0,26
- Hiệu quả của α- NAA bổ sung vào môi trường thể hiện rõ ở tỷ lệ ra rễ của chồi cây Bình vôi, các công thức CT2, CT3 và CT4 đều có tỷ lệ ra rễ đạt 100%
- Ngoài ra, việc bổ sung thêm α- NAA còn có hiệu quả tăng số cao số lƣợng rễ trung bình/chồi và chiều cao chồi. Tất cả công thức có bổ sung α- NAA đều có số rễ trung bình/cây, chiều cao chồi cao hơn công thức đối chứng. Khi tăng lƣợng α- NAA thì số rễ trung bình/chồi giảm dần.
- Sau 30 ngày theo dõi, CT2 có kết quả ra rễ tốt nhất, rễ hình thành sớm, chất lƣợng rế tốt, số rễ/cây đạt 5,15 rễ/chồi, chiều cao đạt 5,66cm. Đồng thời hình thái chồi hình thành cũng khá đẹp, chồi xanh, mập.
Sau khi kết thúc giai đoạn này sẽ tiến hành ƣơm cây bồn mạ, tuy nhiên vì thời gian nghiên cứu của đề tài có hạn nên tác giả chƣa tiếp tục nghiên cứu giai đoạn tiếp theo này.
Qua quá trình thử nghiệm nhân giống Bình vôi bằng ba phương pháp đều cho tỷ lệ nảy mầm tương đối cao. Đặc biệt hương pháp nhân giống bằng hạt không những tỷ lệ nảy mầm cao mà sau thời gian khoảng 2 tháng thì đã thấy hình thành củ. Kết quả này mở ra hướng phát triển gây trồng cây Bình vôi bằng phương pháp gieo hạt là rất khả quan. Hơn nữa, quá trình thu hái, xử lý hạt đơn giản, kinh phí ít có thể áp dụng nhân rộng. Hai phương pháp giâm hom và nuôi cấy mô tỷ lệ nảy mầm tương đối cao.Tuy nhiên, do quy trình xử lý phức tạp, tốn kém kinh phí, thời gian nhiều nên chƣa có dấu hiệu hình thành củ.