2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C.
2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như :
Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230 - 400/mesh
Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm
Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm, dd H2SO4 10%
Các phương pháp kết tinh phân đoạn
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ hồng ngoại (IR) - Phổ tử ngoại (UV)
- Phổ khối lượng va chạm electron (EI - MS) - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR - Phổ DEPT
- Phổ HSQC, HMBC, COSY
2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Hoá chất
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: hexan, metanol, benzen, butanol, etylaxetat, axeton, nước cất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3 (Kyoto, Nhật Bản)
Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Agilent UV-VIS
Phổ hồng ngoại đo trên máy Bruker 270-30, viên nén KBr
Phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lượng bắn phá ở 70 eV
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY được đo trên máy Bruker 125 MHz (Fremont, CA, USA)
2.3. Nghiên cứu các hợp chất 2.3.1. Thu mẫu
Quả thể nấm (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Huống của tỉnh Nghệ An, Việt Nam và được xác định bởi Tiến sĩ Ngô Anh, Khoa Sinh học, Đại học Huế.
2.3.2. Phân lập các hợp chất
Mẫu nấm thu thập được phân loại và sấy khô ở nhiệt độ từ 400-500C trong 48 giờ, sau khi sấy khô vật liệu được nghiền qua (4,3 kg) ngâm với MeOH, với thời gian 8 ngày, sau đó lọc và dịch lọc được cô giảm áp suất trong thiết bị cất quay thu được cao metanol thô (125g). Sau đó hòa tan và phân bố cao metanol trong nước và chiết lần lượt với các dung môi etyl axetat và butanol, cất quay chân không thu được 30g cao etyl axetat và 33g cao butanol.
Sơ đồ 2.1: Chiết cao metanol của quả thể nấm Ganoderma mastoporum
Cao etyl axetat được phân tách trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải hexan-axeton tăng dần độ phân cực từ 100% hexan đến 1:1 thu được 10 phân đoạn.
Thử bằng sắc ký bản mỏng ta thấy phân đoạn 1, 5, 7 không có tritecpenoit và steroit. Phân đoạn F2 ta sử dụng sắc kí cột với hệ dung môi rửa giải là hexan – axeton với tỉ lệ 15:1. Phân đoạn 3 có rất nhiều tritecpenoit hiện màu bằng phun H2SO4 10% trong thời gian 10 phút.
Cao chiết MeOH (125g)
- Ngâm chiết với MeOH - Cất thu hồi dung môi
- Cất thu hồi dung môi Cao etylaxetat 30g Ganoderma mastoporum
4,3 kg
- Phân bố cặn chiết vào H2O - Chiết với etylaxetat
Dịch H2O
- Cất thu hồi dung môi - Chiết với butanol
Cao butanol 33g Dịch H2O
Tiếp tục sắc kí cột phân đoạn 3 với hệ dung môi CHCl3/CH3OH tỉ lệ (100:1 đến 1:1). Phân đoạn 3-1 được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải CHCl3/CH3COOC2H5 tỉ lệ 20:1 và kết tinh phân đoạn với dung môi CHCl3/CH3OH thu được tinh thể chất (B) (16mg).
Phân đoạn 3-2 được tinh chế bằng sắc ký cột và sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi benzen/etylaxetat 20:1 thu được chất (C) (18mg).
Phân đoạn 4-2 được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi benzen/axeton 30:1 thu được chất (D) (13mg).
Sơ đồ 2.2 : Phân lập các hợp chất trong cao etylaxetat F1
Cao etylaxetat 30g
F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
A 120mg
F3-1 F3-2 F3-3 F4-1 F4-2 F4-3 F4-4
Chất B 16 mg
Chất C 18 mg
Chất D 13 mg
CC, SiO2, grad n-hexan/axeton 100:0; 50:1; 25:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1
CC, SiO2, grad benzen/axeton 100:0; 50:1; 25:1; 15:1; 9:1; 6:1; 4:1; 2:1
2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm
- Chuẩn bị mẫu bạch cầu trung tính từ máu người - Thực hiện các phép đo sau:
+ Đo mức độ sản sinh anion supeoxit, + Đo mức độ giải phóng enzim elastase - Phân tích thống kê
Các kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD (standard deviation).
Việc tính toán các giá trị nồng độ ức chế 50% cá thể (IC50) được kết nối với máy tính (PHARM/PCS v.4.2). So sánh thống kê được thực hiện giữa các nhóm sử dụng kiểm định T-Student (Student’s test). Với mức ý nghĩa p < 0,05.
Các phép đo được tiến hành tại Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan.
Chương 3