Nguyên tắc:
Dung môi chứa trong bình cầu (Petroleum ether 30-60) được đun nóng bay hơi lên và nhờ hệ thống làm lạnh nó ngưng tụ nhỏ giọt xuống thấm qua bộ phận chứa mẫu và hòa tan các chất béo tự do có trong mẫu. Quá trình này được lặp lại 15 – 20 lần, tất cả các chất béo được trich ly ra khỏi mẫu. Sản phẩm thu được trong bình cầu là dung môi và các chất béo.
Các bước tiến hành:
Cân 0.5g mẫu cho vào giấy lọc và gói lại.(Wm)
Để mẫu vào chén và đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến khi khối lượng không đổi(khoảng 4-5 giờ đối với mẫu khô và 24 giờ đối với mẫu ướt). Sau đó lấy mẫu ra đặt vào bình hút ẩm và cân nóng (W1).
Đong 90-100 ml Petroleum ether cho vào bình cầu
Cho mẫu vào bộ phận chứa mẫu của hệ thống phân tích lipid. Mở nước, bật công tắc máy, chỉnh công tắc máy ở vị trí 75%.
Sau 6-8 giờ (15-20 lần lặp lại) ly trích tắt máy, 30 phút sau tắt nước.
Lấy mẫu ra khỏi hệ thống phân tích, đặt vào tủ hút khoảng 15 phút và cho vào tủ sấy ở 105oC đến khi trọng lượng không thay đổi (khoảng 24 giờ).
Đặt mẫu vào bình hút ẩm và cân nóng (W2).
% 100 0014 .
% 0 x
Dr mx
x V N V O
0014 100 , 0 )
% ( x
m x V N V o
Cách tính:
(mẫu khô) (A.8)
Hoặc (mẫu ướt) (A.9)
Trong đó:
: khối lượng mẫu
W1: khối lượng mẫu trước ly trích W2: khối lượng mẫu sau ly trích
%Dr: % độ khô ( = 100% - % ẩm độ)
A.5 Xác định vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm (theo NMKL 86:2006 - Nordic Commoittee Food Analysis- Ủy Ban Phân Tích Thực Phẩm Bắc Âu)
Phạm vi áp dụng:
Phương pháp này thích hợp cho việc xác định vi sinh vật hiếu khí có thể phát triển trong thực phẩm và có thể được áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.
Định nghĩa:
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí khi phép thử được thực hiện theo phương pháp được mô tả.
Tổng số khuẩn lạc hiếu khí là số vi sinh vật hiếu khí có thể phát triển trên một gram thực phẩm được tìm thấy từ phép thử theo phương pháp được mô tả.
Nguyên tắc:
Đồng nhất mẫu với dịch pha loãng bằng máy dập mẫu. Từ dung dịch mẫu sau khi đồng nhất, tiến hành pha loãng thập phân thành nhiều nồng độ. Ở mỗi nồng độ thích hợp, chuyển 1mL dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa petri, sau đó trộn đều mẫu với môi trường thạch không chọn lọc.
Ủ mẫu trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong 72 ± 6 giờ (hoặc có thể ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian theo yêu cầu).
Quy trình phân tích:
Chuẩn bị mẫu:
Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng SPW (Saline peptone water), đồng nhất mẫu trong khoảng thời gian 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu. Dịch mẫu sau đồng nhất có nồng độ 10-1. Tiếp tục pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp.
100 )*
%
* (
) 2 1
% (
Dr Wm
W Lipid W
100 Wm *
) 2 1
% (W W
Lipid
Cấy mẫu:
Chuyển 1 mL ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa). Tiếp theo cho vào mỗi đĩa khoảng 15 – 20 mL môi trường PCA (Plate count agar) ở nhiệt độ 45oC. Trộn đều mẫu bằng cách di chuyển đĩa theo hình số 8. Từ giai đoạn pha loãng đến giai đoạn thêm môi trường không quá 20 phút.
Ủ đĩa:
Sau khi môi trường đã đông, lật ngược các đĩa petri ử trong tủ ủ ở 30 ± 1oC hay ử ở nhiệt độ phòng trong 72 ± 6 giờ.
Tính kết quả:
Đếm khuẩn lạc:
Nên chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 – 250 để đếm, nếu có thể nên dùng máy đếm khuẩn lạc để đếm, thời điểm đếm đĩa nằm trong khoảng thời gian 72 ± 6 giờ, nhiệt độ 30 ± 1oC hay nhiệt độ phòng.
Khi đếm khuẩn lạc nên thực hiện dưới ánh sáng dịu.
Tránh nhầm lẫn giữa khuẩn lạc nhỏ như đầu ngòi bút và các chấm nhỏ do môi trường không hòa tan, chất béo,... các mẫu nhỏ giống khuẩn thì không đếm như khuẩn lạc.
Tính kết quả: (theo ISO 7218:1996)
Nếu chỉ có một nồng độ cho khoảng đếm thích hợp, tính số đếm trung bình từ hai đĩa của nồng độ đó và ghi nhận kết quả như tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Các đĩa có số khuẩn lạc thuộc khoảng 25 – 250. Số khuẩn lạc trên 1 gram mẫu (ml mẫu) tính theo công thức sau:
N = V n n d
C ) 1 , 0
( 1 2 (A.10) Trong đó:
N: Số vi khuẩn có trong mẫu thử (CFU/g).
C: Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở 2 độ pha loãng kế tiếp nếu các đĩa đều có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250.
V: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml).
n1: Số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất.
n2: Số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai.
d: Nồng độ tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
Việc làm tròn số chỉ lấy hai chữ số có ý nghĩa, chỉ áp dụng trong trường hợp xác định vi sinh vật hiếu khí. Khi làm tròn số, nâng chữ số thứ hai lên số có giá trị cao hơn khi số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 và thay các số lẻ
bằng số 0. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn hoặc bằng 4, thay nó bằng số không và giữ nguyên số thứ hai.
Đối với những trường hợp bất thường ( không đĩa nào trong cặp đĩa hoặc chỉ một đĩa có sô đếm thích hợp...) có thể đếm và ghi nhận kết quả theo hướng dẫn sau (FDA – 1984).
Hai đĩa có số đếm dưới 25:
Đếm số khuẩn lạc thực có trên mỗi đĩa cấy cùng nồng độ đó, tính số khuẩn lạc trung bình cho mỗi đĩa và nhân với số lần pha loãng để có được ước định của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ước định tính từ những đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 – 250.
Hai đĩa có số đếm trên 250:
Đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6...diện tích đĩa) rồi quy ra cho diện tích toàn đĩa. Giá trị trung bình của hai đĩa được ghi nhận như tổng số vi sinh vật hiếu khí ước định. Đánh dấu (*) để biết rằng đây là kết quả ước định tính từ những đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 – 250.
Dạng mọc lan:
Các dạng mọc lan thường thuộc ba loại khác nhau:
(1) Một chuỗi khuẩn lạc không tách rời hẳn khỏi nhau như được tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật.
(2) Dạng mọc lan trong lớp nước mỏng giữa thạch và đáy đĩa.
(3) Dạng mọc lan trong lớp nước mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch.
Nếu các đĩa cấy có dạng mọc lan phát triển nhiều đến mức: a) vùng mọc lan (kể cả vùng mà sự phát triển bị kìm hãm) vượt quá 50% diện tích đĩa;
hoặc b) vùng mà sự phát triển bị kìm hãm vượt quá 25% diện tích đĩa đều được ghi nhận là đĩa mọc lan. Xác định số đếm trung bình cho mỗi nồng độ, ghi nhận trung bình số học của các giá trị này như tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Khi cần phải đếm những đĩa chứa dạng mọc làn không bị loại bởi kiểu a và b nói trên, đếm mỗi dạng mọc lan thuộc 3 kiểu trên như từ một nguồn. Đối với kiểu 1, nếu chỉ 1 chuỗi thì đếm như một khuẩn lạc đơn. Nếu có một hay vài chuỗi có vẻ như phát triển từ những nguồn khác nhau thì đếm mỗi nguồn như 1 khuẩn lạc riêng biệt. Không được đếm mỗi nhóm sinh trưởng riêng biệt trong một chuỗi kiểu này như một khuẩn lạc tách rời. Dạng 2 và 3 thường sinh ra những khuẩn lạc tách rời và được đếm như những khuẩn lạc riêng biệt. Kết hợp các số đếm từ dạng mọc lan và số đếm khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Đĩa không có khuẩn lạc
Khi trên các đĩa từ mọi nồng độ pha loãng đều không có khuẩn lạc nào, ghi kết quả tổng số vi sinh vật ít hơn 1 lần nồng độ pha loãng thấp nhất đã được sử dụng. Đánh dấu (*) để biết kết quả này là ước định do số đếm nằm ngoài ngưỡng 25 – 250.
Một đĩa thuộc khoảng 25 – 250, đĩa thứ hai quá 250
Đếm cả hai đĩa, dùng cả kết quả đĩa có số khuẩn lạc quá 250 để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, mỗi nồng độ 1 đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 – 250
Khi 1 đĩa của 1 nồng độ nằm trong ngưỡng 25 – 250, đĩa thứ hai có dưới 25 hoặc 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng cả 4 số đếm để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, một nồng độ có 2 đĩa trong ngưỡng, một nồng độ chỉ có 1 đĩa trong ngưỡng 25 – 250
Khi cả 3 đĩa của 1 nồng độ chứa 25 – 250 khuẩn lạc và chỉ 1 đĩa của nồng độ khác chứa 25 – 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng kết quả của cả đĩa dưới 25 lẫn đĩa trên 250 khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
PHỤ LỤC B
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ