NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Bố trớ thớ nghiệm ủỏnh giỏ chất lượng vắc xin trờn quy mụ phũng thớ nghiệm
Vắc xin ủược kiểm nghiệm ủể ủỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu vụ trựng, an toàn và hiệu lực tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I theo TCVN, so sánh với hồ sơ kỹ thuật của nhà sản xuất và tiêu chuẩn của OIE.
- Chỉ tiêu Vô trùng
Cỏc mụi trường sử dụng ủể kiểm tra vắc xin với số lượng như sau: 2 ống thạch máu, 2 ống thạch nấm, 2 ống thạch thường, 2 ống nước thịt, 2 ống nước thịt gan yếm khí.
Cách tiến hành: Nhỏ 0,1 ml vắc xin cần kiểm tra vào mỗi ống môi trường. Sau khi cấy, toàn bộ mụi trường kiểm tra ủược bồi dưỡng trong tủ ấm 370C, riờng mụi trường thạch nấm ủể ở nhiệt ủộ phũng, theo dừi liờn tục trong 7 ngày. Nếu ở các môi trường kiểm tra không có nấm và vi khuẩn mọc thì kết luận vắc xin vô trùng.
- Chỉ tiêu An toàn
Với mỗi lụ vắc xin sử dụng 20 gà 4 tuần tuổi, khỏe mạnh, trong ủú 10 gà ủược tiờm vắc xin cỳm gia cầm vào dưới da cổ với liều 2ml/con và 10 gà ủối chứng không tiêm vắc xin.
Toàn bộ gà ủược theo dừi 21 ngày. Nếu trong quỏ trỡnh theo dừi gà phỏt triển bình thường không có dấu hiệu triệu chứng cục bộ, toàn thân và bất kỳ dấu hiệu khác thường nào thì kết luận lô vắc xin an toàn.
- Chỉ tiêu Hiệu lực
Với mỗi lụ vắc xin sử dụng 25 gà 4 tuần tuổi, khỏe mạnh, trong ủú 15 gà ủược tiờm vắc xin cỳm gia cầm vào dưới da cổ với liều 0,5 ml/con và 10 gà ủối chứng khụng tiờm vắc xin.
Toàn bộ gà ủược theo dừi 21 ngày, kết thỳc 21 ngày theo dừi lấy mỏu
Formatted: 2 Formatted
Formatted: Font color: Blue
Formatted Formatted: 3, None Deleted: ả
ả
- Vacxin cúm gia cầm vô hoạt subtype H5N1 chủng Re-6 sản xuất tại Da Hua Nong (ðại Hoa Nông - Trung Quốc) do cụng ty Vinavetco nhập khẩu.ả
* Môi trường và hoá chất bảo quản bệnh phẩm:ả
Bệnh phẩm là dịch ngoáy ổ nhớp (swab), họng, khớ quản ủược bảo quản trong dung dịch vận chuyển. Có thể sử dụng môi trường 199 hoặc môi trường glycerol có bổ sung kháng sinh, bảo quản ở 40C từ 1 - 2 ngày, nếu ủể lõu hơn nờn giữ ở nhiệt ủộ -200C.ả
- Môi trường 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bũ)ả
- Mụi trường Glycerolả
+ Bổ sung khỏng sinh:ả
Penicillin G
Deleted: 3.3.1.…kiểm nghiệm…vacxin Deleted: Vacxin
Deleted: ả 3.3.1.1.1 …v Deleted: vacxin Deleted: vacxin…vacxin
Deleted: 3.3.1.1.2…a
Deleted: vacxin…vacxin…vacxin
Deleted: vacxin
Deleted: ả 3.3.1.1.3…h
Deleted: vacxin…vacxin…vacxin
Deleted:
... [79]
... [81]
... [76]
... [82]
... [80]
... [78]
... [83]
... [77]
... [84]
... [75]
chắt huyết thanh của từng gà kiểm tra hiệu giá kháng thể. Gà tiêm vắc xin có hiệu giá kháng thể ít nhất 4 log2 thì kết luận vắc xin có hiệu lực bảo hộ . 2.3.1.2. Bố trớ thớ nghiệm ủỏnh giỏ chất lượng vắc xin ngoài thực ủịa
* Bố trí thí nghiệm:
Với mỗi lô vắc xin chúng tôi sử dụng 250 gà Lương Phượng 4 tuần tuổi và chia làm 3 lô thí nghiệm như sau:
Lô thí nghiệm
Số lượng (con)
Liều vắc xin và
ủường tiờm Ghi chỳ
Lô 1 50 Không dùng vắc xin ðối chứng
Lô 2 50 2 ml/con, tiêm dưới da cổ An toàn Lô 3 150 0,5 ml/con, tiêm dưới da cổ Miễn dịch
* Phương pháp tiến hành
- Trước khi gà ủược tiờm vắc xin, lấy mẫu mỏu ngẫu nhiờn 100 gà ủể kiểm tra kháng thể. Mỗi con lấy 1ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dựng ủể xột nghiệm. Chọn lựa những con cú hiệu giỏ khỏng thể < 3log2 ủể tiến hành thí nghiệm.
- đàn ựược theo dõi liên tục 8 tuần sau khi tiêm vắc xin.
- Lấy máu gà sau tiêm vắc xin: lấy mẫu máu ngẫu nhiên 50 con lô miễn dịch và 50 con lụ ủối chứng tại cỏc thời ủiểm 3, 4, 6 và 8 tuần sau tiờm vắc xin.
* Các chỉ tiêu khảo sát
- đánh giá ảnh hưởng của vắc xin ựến một số chỉ tiêu của gà: Trong quỏ trỡnh thử nghiệm, theo dừi hàng ngày ủàn gà khảo nghiệm vắc xin về tỡnh hỡnh sức khỏe, như: tăng trọng, tỷ lệ chết và tỡnh hỡnh bệnh của ủàn gà nhằm ủỏnh giỏ cỏc tỏc dụng phụ của vắc xin.
Số con chết
+ Tỷ lệ chết (%) = x 100 Số con khảo sát
+ Kiểm tra những phản ứng bất lợi và các triệu chứng lâm sàng: Gà ủược theo dừi về cỏc triệu chứng lõm sàng và cỏc phản ứng cục bộ tại vị trớ
Formatted: Font: Not Bold, Font color: Blue, Swedish (Sweden)
Formatted: Indent: First line: 1.27 cm, Line spacing: Multiple 1.45 li, No widow/orphan control
Formatted: Indent: First line: 1.27 cm, Line spacing: Multiple 1.45 li, No widow/orphan control
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin Deleted: 3.3.1.1.4
Deleted: ả
Deleted: 3.3.1.2. Bố trí thí nghiệm khảo nghiệm vacxinả
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vắc xin.
+ Thể trọng: Thể trọng của gà trong khảo sỏt ủược cõn trước ngay khi tiêm vắc xin và ngay khi thí nghiệm kết thúc.
- đánh giá hiệu giá kháng thể của gà ngay trước khi tiêm và tại các thời ủiểm 3, 4, 6 và 8 tuần sau khi tiờm vắc xin. Mẫu ủược bảo quản theo quy ủịnh và ủược chuyển về Trung tõm Kiểm nghiệm thuốc thỳ y Trung ương I, ủược tỏch huyết thành và ủược xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng thể H5 bằng phản ứng HI.
* Phương phỏp cụng cường ủộc
Xỏc ủịnh hiệu quả bảo hộ cho gà sau khi tiờm vắc xin thụng qua phõn tớch triệu chứng, bệnh tớch, thời gian sống sút của gà sau khi cụng cường ủộc bằng cách nhỏ mắt và mũi mỗi gà 106 EID50 chứa trong 0,2ml dung dịch vi rỳt cụng cường ủộc.
Tại thời ủiểm 3 tuần sau miễn dịch, bắt ngẫu nhiờn 20 gà miễn dịch và 10 gà ủối chứng tiến hành cụng cường ủộc tại Trung tõm Kiểm nghiệm Thuốc Thỳ y TW1. Trước khi thớ nghiệm gà ủược lấy mỏu ủể xỏc ủịnh khỏng thể kháng vi rút cúm H5N1 bằng phản ứng HI.
Ghi kết quả HI. ðể 2 ngày theo dừi ủàn gà này.
Chỉ chấp nhận tiến hành cụng cường ủộc khi: Gà khỏe mạnh, HI trong ủàn gà tiờm phũng ủược ghi rừ cho từng cỏ thể. Số gà ủối chứng khỏe mạnh và không có kháng thể HI (hiệu giá bằng 0).
Cụng cường ủộc: Vi rỳt A/ H5N1 ủược pha loóng trong PBS sao cho cú 106 EID50 trong 0,2ml (4 giọt). Nhỏ cẩn thận 1 giọt vào 1 bên mắt, nhỏ cả 2 mắt và 2 giọt vào hai lỗ mũi gà. Khi gà chết, mổ khám bệnh tích và lấy mẫu xỏc ủịnh nguyờn nhõn gà chết.
ðể theo dõi sự nhân lên của vi rút cúm H5N1 trong cơ thể và tỷ lệ dương tớnh trong ủàn sau khi cụng cường ủộc, chỳng tụi lấy dịch swab ở hầu họng sau cỏc ngày thứ 5 và ngày thứ 10 và những con chết trước ủú ủể kiểm tra bằng phương phỏp Realtime RT-PCR. Mẫu ủược xột nghiệm tại Trung tõm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương.
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
Deleted: vacxin
Deleted:
Deleted: virus
Deleted: virus
Deleted:
Deleted: Virus
Deleted: virus
Cách lấy dịch ngoáy hầu họng (swab): Cho tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoỏy thu lấy dịch nhày, sau ủú từ từ rỳt ra rồi ủưa vào ống dung dịch bảo quản, bẻ que vừa với chiều dài của ống, ủúng kớn nắp.
Xử lý và tiờu hủy gà sau khi cụng cường ủộc: Sau khi kết thỳc thớ nghiệm, tất cả xỏc gia cầm, cỏc ủồ thải ủều ủược ủem thiờu huỷ trong lũ ủốt xác công nghiệp tại phòng thí nghiệm BSL2. Thuốc sát trùng sử dụng trong thí nghiệm là Virkon S của hãng Bayer.
2.3.1.3. đánh giá sự bài thải vi rút trên ựàn gà sau khi sử dụng vắc xin
Chỳng tụi lấy mẫu dịch ổ nhớp (swab) vào cỏc thời ủiểm 0, 3, 4, 6, 8 tuần sau tiờm vắc xin ủể xỏc ủịnh xem vi rỳt cỳm H5 cú lưu hành trờn ủàn gà trong suốt thời gian giỏm sỏt hay khụng. Sự cú mặt của vi rỳt ủược xỏc ủịnh bằng phản ứng Realtime RT - PCR tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I.
2.3.2. Phương pháp xét nghiệm
a) Phản ứng HA (Hemagglutination test) - Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn: Kháng nguyên là vi rút cúm subtype H5 chuẩn do Viện Thú y Harbin cung cấp.
+ Hồng cầu gà: hồng cầu của gà trống trưởng thành (1,3 kg), không có kháng thể Cúm và Newcastle. Lấy máu tĩnh mạch cánh bằng bơm tiêm 5 ml cú chứa 1 ml Natri citrat 5%. Hồng cầu ủược rửa 3 lần trong nước sinh lý 0,85% bằng cỏch ly tõm 2000 vũng/phỳt, 2 lần ủầu li tõm 5 phỳt, lần cuối cùng li tâm 10 phút. Loại bỏ nước trong ở trên, cuối cùng chỉ lấy hồng cầu lắng ở dưới ủỏy ống, pha thành dung dịch 1% trong nước sinh lý 0,85%. Bảo quản ở 40C, 4-5 ngày.
- Dụng cụ: ủĩa chữ V gồm 12 cột (từ 1-12) và 8 hàng (từ A-H), ống hỳt, micro pipet 8 kênh, nước sinh lý 0,85 % vô trùng.
Tiến hành phản ứng:
- Cho 50 àl nước sinh lý 0,85 % vào tất cả cỏc giếng.
Deleted: 3
- Cho 50 àl khỏng nguyờn chuẩn vào cỏc giếng từ A1- H1.
- Pha loóng khỏng nguyờn chuẩn theo cơ số 2 bằng cỏch trộn ủều rồi chuyển 50 àl khỏng nguyờn chuẩn từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 trộn ủều và làm lần lượt như trờn ủến giếng thứ 11 thỡ bỏ ủi 50 àl. ðộ pha loóng vi rỳt hay hiệu giỏ vi rỳt ở giếng sau gấp hai lần giếng ủứng trước nú, ủộ pha loóng lần lượt theo thứ tự là 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128…
- Cột 12 ủối chứng cú 50 àl hồng cầu gà 1% và 50 àl nước sinh lý 0,85%.
- Cho 50 àl hồng cầu gà 1% vào tất cả cỏc giếng phản ứng.
- Lắc nhẹ ủĩa, ủể yờn ở nhiệt ủộ phũng. Sau 20- 25 phỳt khi giếng ủối chứng hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả.
ðọc kết quả:
- Phản ứng dương tính: Có hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết với kháng nguyên thành hạt lấm tấm xung quanh giếng.
- Phản ứng õm tớnh: Hồng cầu lắng thành cục trũn ủỏ dưới ủỏy giếng.
đánh giá kết quả: Hiệu giá vi rút ựược tắnh ở ựộ pha loãng cao nhất cũn quan sỏt thấy hiện tượng ngưng kết hồng cầu ủược gọi là 1 ủơn vị ngưng kết (hay 1 ủơn vị HA)
* ðọc kết quả:
b) Phương phỏp xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng thể - phản ứng HI (Haemagglutination Inhibition)
Dùng phản ứng huyết thanh ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination inhibition - HI) ủể xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng thể trong huyết thanh của gà ủó ủược tiờm vắc xin cỳm gia cầm A/H5N1.
Chuẩn bị:
- Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn: Kháng nguyên là vi rút subtype H5 chuẩn do Viện Thú y Harbin cung cấp.
Xỏc ủịnh 4 ủơn vị ngưng kết hồng cầu của khỏng nguyờn chuẩn:
Trước khi làm phản ứng xỏc ủịnh 1 ủơn vị ngưng kết hồng cầu của khỏng nguyờn chuẩn, từ ủú xỏc ủịnh 4 ủơn vị ngưng kết hồng cầu dựng trong phản ứng huyết thanh ngăn trở ngưng kết hồng cầu, nếu phản ứng ngưng kết ở hiệu giỏ vi rỳt là 1/160 (ủõy chớnh là 1 ủơn vị HA) thỡ liều sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu tương ứng với hiệu giá vi rút là 1/40 (1/160ì4) tức là 4 ủơn vị HA.
Chuẩn ủộ khỏng nguyờn 4HA: Sau khi khỏng nguyờn ủược pha 4HA.
Trước khi làm phản ứng HI, khỏng nguyờn phải ủược chuẩn ủộ lại cho chớnh xỏc là 4HA mới ủược dựng cho phản ứng HI.
+ Hồng cầu gà 1 %: Chuẩn bị như trong phản ứng ngưng kết hồng cầu.
+ Huyết thanh của gà cần xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng thể : Lấy mỏu gà chắt huyết thanh, vô hoạt huyết thanh 560C/30 phút, bảo quản 4-80C.
- Dụng cụ: ủĩa chữ V gồm 12 cột (từ 1-12) và 8 hàng (từ A-H), ống hỳt, micro pipet 8 kênh, nước sinh lý 0,85 % vô trùng.
Tiến hành phản ứng:
- Cho 25 àl nước sinh lý 0,85 % vào tất cả cỏc giếng.
- Cho 25 àl huyết thanh cần kiểm tra vào hàng giếng ủầu tiờn (từ A1 ủến H1).
- Pha loóng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cỏch trộn ủều rồi chuyển 25 àl từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và lần lượt như trờn ủến giếng thứ 11 thỡ bỏ ủi 25 àl. ðộ pha loóng huyết thanh ở giếng sau gấp hai lần giếng ủứng trước nú, ủộ pha loóng lần lượt theo thứ tự là 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128…
- Cho 25 àl khỏng nguyờn 4HA vào tất cả cỏc giếng từ giếng 1-11.
Thờm 25 àl muối sinh lý vào hàng ủối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc nhẹ ủĩa và ủể ở nhiệt ủộ phũng 30 phỳt cho khỏng nguyờn và kháng thể (nếu có) kết hợp với nhau.
- Cho 50 àl hồng cầu gà 1% vào tất cả cỏc giếng - Lắc nhẹ ủĩa, ủể yờn ở nhiệt ủộ phũng.
Sau 20- 25 phỳt khi giếng ủối chứng hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả.
ðọc kết quả:
- Phản ứng dương tớnh: hồng cầu lắng thành cục trũn ở ủỏy giếng giống như ủối chứng hồng cầu.
- Phản ứng âm tính: có hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết lấm tấm ủều dưới ủỏy giếng.
đánh giá kết quả: Hiệu giá kháng thể là ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở ủú vẫn cú hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu.
d) Phản ứng Real time RT-PCR
* Khái quát Real time PCR
Real time PCR là kỹ thuật nhõn bản DNA ủớch trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào cỏc chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch ủại trong ống phản ứng ủược hiển thị cựng lỳc với phản ứng khuyếch ủại xảy ra ủể cú thể ủọc ủược sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Sự phỏt hiện sản phẩm PCR sẽ dựa vào cường ủộ huỳnh quang của bình phản ứng. Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ
nhiệt và tỷ lệ thuận với sản phẩm ủược nhõn bản. Cường ủộ phỏt huỳnh phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang (Phạm Hùng Vân, 2008).
Phương phỏp Real time RT-PCR là kỹ thuật ủể phỏt hiện với virus cú nhân là RNA, như virus cúm H5N1. Phản ứng cần qua bước phiên mã ngược (Reverse transcription) ủể chuyển RNA của virus thành DNA, làm khuôn mẫu cho quá trình PCR.
* Nguyờn liệu phương phỏp Real time RT-PCR dựng cho xỏc ủịnh lượng virus cúm H5N1.
- Khuụn RNA là ủoạn cần nhõn bản.
- Nước cất vô trùng (Rnase-free).
- RNA ủối chứng dương tớnh M, H5, H7 của virus cỳm H5N1.
- Hai ủoạn mồi oligonucleotit (primer), và probe (mẫu dũ).
- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.
- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
- Dung dịch ủệm, Mg2+...
* Thực hiện kỹ thuật Real time RT-PCR:
- Công thức pha hỗn hợp nhân gen cho Real time RT-PCR (Invitrogen Superscript One-step RT-PCR) :
H2O 5.5àl
2X Reaction mix 12.5àl
Primer forward 0.5àl
Primer reverse 0.5àl
Probe 1.5àl
Enzym Taq Polymerase 0.5àl
- Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu RNA và cho hỗn dịch phản ứng (20àl) vào ống Smart Cycler.
- Cho 5ộl mẫu RNA vào ống Smart Cycler. đóng nắp ống, số ống phản
ứng tương ứng với với mẫu xét nghiệm.
- Cho 5àl RNA ủối chứng dương vào ống ủối chứng dương tớnh và 5àl nước sạch RNase vào ống ủối chứng õm tớnh.
- ðặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt ủầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cựng với mẫu ủối chứng dương tính, âm tính và phần ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy.
- Cài ủặt chương trỡnh phõn tớch dữ liệu cho mỏy chu kỳ nhiệt Smart Cycler và chạy chương trình.
Phân tích kết quả xét nghiệm: phân tích kết quả dựa vào chu kỳ ngưỡng Ct (threshold cycle). Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời ủiểm này thiết bị real-time ghi nhận ủược tớn hiệu huỳnh quang phỏt ra từ ống phản ứng bắt ủầu vượt qua cường ủộ huỳnh quang nền. ðể cú thể xỏc ủịnh ủược cường ủộ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường ủộ tớn hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ ủầu, chỳng ta gọi là cỏc chu kỳ nền, và lấy trung bỡnh cộng của cỏc cường ủộ huỳnh quang này làm cường ủộ huỳnh quang nền. ðường cắt ngang ủi qua cường ủộ huỳnh quang nền này ủược gọi là ủường nền. Chu kỳ ngưỡng là trị số ủược xỏc ủịnh bằng số chu kỳ mà ở ủú ủường nền cắt ủường biểu diễn khuếch ủại.