Molekulare Fluoreszenz ist ein dreistuger Prozess, der typischerweise bei aromatischen Molekülen auftritt. Derartige Moleküle werden als Fluorophore oder Fluorocrome be- zeichnet. Fluorophore sind in der Lage, Licht zu absorbieren und wieder zu emittie- ren. Die Prozesse zwischen Absorption und Emission werden typischerweise durch ein Jablonski-Diagram dargestellt (siehe Abbildung 2.7)[82].
Ein relaxierter Fluorophor bendet sich ohne Anregung mit hoher Wahrscheinlichkeit im Schwingungsniveau v=0 des S0-Grundzustands [106] und kann durch Absorption von Strahlung in einen angeregten Singulettzustand (S1) versetzt werden. Die Absorption von Photonen erfolgt meist auf sehr kurzen Zeitskalen von etwa 10−15 bis 10−14 s [156]. Das Molekỹl erfọhrt nach Anregung Stửÿe mit seiner Umgebung. Dabei gibt es Energie ab (engl. vibrational relaxation), wodurch es auf der Leiter seiner Schwingungsniveaus (vi) immer weiter nach unten klettert, bis es im Schwingungsgrundzustand des elektronisch angeregten Zustands angekommen ist (siehe Abb.2.7, S1, v0). Im Fall von Fluoreszenz (dem strahlende ĩbergang) kann die Umgebung den groÿen Energiebetrag nicht aufneh- men, der nửtig wọre, um das Molekỹl in den elektronischen Grundzustand zurỹckkehren zu lassen. Daher wird die verbleibende Anregungsenergie durch eine schnelle, spontane Emission abgegeben, was als Fluoreszenz bezeichnet wird [7]. Der Prozess der Fluores- zenz erfolgt in der Regel in einem Zeitrahmen zwischen 10−9 und 10−7 Sekunden [60].
Anschlieÿend bendet sich das Molekül wieder im elektronischen Grundzustand. Da die Emission erst nach teilweiser Abgabe der Energie an die Umgebung stattndet, ist die emittierte Strahlung etwas energieọrmer als die Anregungsstrahlung. Dies fỹhrt dazu, dass die Emission im Vergleich zur Anregung in den langwelligeren Spektralbereich ver- schoben ist. Diese Dierenz in den Wellenlọngen zwischen Anregung und Emission wird
Abbildung 2.7: Jablonski-Diagram als vereinfachte Darstellung der elektronischen Ener- gieniveaus eines Molekỹls. Durchgezogene Pfeile: ĩbergọnge zwischen unterschiedlichen Energieniveaus, bei denen ein Photon absorbiert (An- regung) oder emittiert (Fluoreszenz, Phosphoreszenz) wird. Gepunktete Pfeile: Strahlungslose ĩbergọnge, z.B. Schwingungsrelaxation oder inter- system crossing. Kurze, schwarze Pfeile: Spinzustọnde der Elektronenpaa- re. Si: Singulettzustọnde; Ti: Triplettzustand; vi: Schwingungszustọnde.
Verọndert nach Atkins 2006 [7].
als Stokes-Verschiebung bezeichnet [164]1. Wọhrend der Anregung eines Elektrons kann es seinen Spinzustand behaltend auf ein hửheres Energieniveau gelangen, auf den so genannten angeregten Singulettzustand. Wenn aber sein Spinzustand verọndert wird, kommt es in einen angeregten Triplettzustand. Ein Singulett/Singulett-ĩbergang (S0- S1) ist viel wahrscheinlicher als ein Singulett/Triplett-ĩbergang (S0-T1). Jedoch ist es mửglich, dass ein Elektron ohne Aussendung von Strahlung von einem angeregten Singu- lettzustand in einen weniger energiereichen Triplett-Zustand kommt. Dieser Prozess wird als Interkombination (engl. intersystem crossing) bezeichnet. Im Schwingungsgrundzu- stand des Triplettzustands ist das Molekül zeitweise gefangen, da seine Energie unter der des Singulettzustands liegt. Die Anregungsenergie ist zu groÿ, um von der Umge- bung aufgenommen zu werden und die Abgabe der Energie in Form von Strahlung ist in diesem Zustand sehr unwahrscheinlich, wodurch die Rückkehr in den Grundzustand nur langsam erfolgt. Dieser strahlende ĩbergang wird als Phosphoreszenz bezeichnet und
1Die Stokes-Verschiebung ist somit eine der Hauptgrỹnde fỹr das hohe Signal/Rausch-Verhọltnis in der Fluoreszenzmikroskopie, da durch die Wellenlọngenverschiebung das Anregungslicht durch geeignete Filter optimal von dem emittierten Licht getrennt werden kann.
kann lange anhalten, nachdem die Anregung abgeschaltet ist [7]. Der ĩbergang aus einem Triplettzustand in den Grundzustand erfolgt mit Halbwertszeiten zwischen 10−4 und 102 Sekunden [60]. Wie oben beschrieben, kann ein angeregtes Molekül sowohl durch mehre- re strahlungslose als auch durch Photonen emittierende Schritte in seinen Grundzustand zurückkehren. Der bevorzugte Weg zum Grundzustand ist derjenige, der die Lebens- dauer des angeregten Zustands minimiert. Ist die Deaktivierung durch Fluoreszenz im Vergleich zu strahlungslosen Prozessen schnell, werden solche Emissionen beobachtet. Be- sitzt andererseits der strahlungslose Weg die günstigere Geschwindigkeitskonstante, dann tritt Fluoreszenz nicht relevant auf [156]. Abbildung 2.7 fasst die elektronischen Ener- gieniveaus, die strahlenden und strahlungslosen ĩbergangsmửglichkeiten eines Molekỹls zusammen.
2.5.1.1 Extinktionskoezient, Quantenausbeute und Fluoreszenz-Lebensdauer Bei uoreszenzbasierten Messungen sind drei Fluorophor-spezische Faktoren von beson- derer Bedeutung: Der Extinktionskoezient, die Quantenausbeute und dieFluoreszenz- Lebensdauer.
Der Extinktionskoezientεist ein Maÿ dafür, wie viel elektromagnetische Strahlung eine spezielle Substanz in molarer Konzentration bei einer Durchtrittslọnge von 1 cm und bei einer bestimmten Wellenlọnge absorbiert [184].εerhọlt man ỹber Gleichung2.1mit der Extinktion Eλ(Verminderung der Intensitọt des gemessenen Lichts im Photometer), der Stomengenkonzentration c der Lửsung in der Messkỹvette, und der Schichtdicke d der Messküvette (1 cm). Eλ wiederum wird abgeleitet vom Lambert-Beerschen Gesetz 2.2, wobei I0der Intensitọt des einfallenden Lichts und I1 der Intensitọt des transmittierten Lichts entspricht.
ε= Eλ
cd (2.1)
Eλ =lg(I0
I1
) (2.2)
εstellt somit ein Maÿ für die Eigenschaft eines Fluorophores dar, wie viele Photonen mit diskreter Energie durch 1 Mol der Fluorophore auf einem optischen Weg von 1 cm ab- sorbiert werden kửnnen. Es hat die Einheit cm-1 M-1. Herkửmmliche Fluorophore haben einen molaren Extinktionskoezient zwischen 5000 und 250,000 cm−1M−1. Generell wer- den Fluorophore mit mửglichst hohem Extinktionskoezienten bevorzugt, da bei einem Fluorophor mit hửherem im Vergleich zu einem Fluorophor mit niedrigerem (aber gleicher Quantenausbeute) die Anregungsintensitọt geringer sein kann und dadurch zell-
biologische Proben geschont werden (vgl. auch Kapitel2.5.1.3).
Die Quantenausbeute (engl. Quantum yield; QY) beschreibt die Anzahl an emittierten Photonen im Verhọltnis zur Menge absorbierter Photonen neben anderen Relaxations- prozessen [106]. Bei der Fluoreszenzmikroskopie verwendete Farbstoe haben eine Quan- tenausbeute zwischen 0,1 und 1,0, wobei ein Farbsto mit einer hohen QY von 1 ein sehr eektiver Fluorophor ist und für mikroskopische Untersuchungen bevorzugt wird.
Zum Beispiel die AlexaFluor-, Bodipy- oder Di-Serien von Life Technologies sind solche Fluorophore. Der in dieser Arbeit họug verwendete Fluorophor Bodipy besitzt, gemes- sen in einer Lipiddoppelschicht, eine Quantenezienz von 0,9 [80], wọhrend DiIC18(7) in Methanol eine Quantenezienz von 0,07 besitzt [133]. Generell werden Fluorophore mit einer hohen Quantenausbeute bevorzugt. Vereinfacht lọsst sich sagen, dass Fluorophore mit hửherer Quantenausbeute hửhere Emissionen erzeugen.
Die dritte wichtige Eigenschaft eines Fluorophores ist die Fluoreszenz-Lebensdauer. Sie gibt die mittlere Zeit an, die ein Fluorophor in einem angeregten Zustand bleibt, bevor er ein Photon emittiert und damit in den Grundzustand zurückkehrt (vgl. Abb.2.7). Dabei ist zu beachten, dass es sich bei Fluoreszenz um einen zufọlligen Zerfall handelt und so- mit auch die angegebene Fluoreszenz-Lebensdauer nur einen mittleren Wert darstellten kann bei dem der Fluorophor vom angeregten in den Grundzustand unter Aussendung von Photonen zurückkehrt [106].
2.5.1.2 Fluoreszenz-Lửschung und Excimerbildung
Die Intensitọt des emittierten Fluoreszenzlichts kann durch unterschiedliche Prozesse ver- ringert werden. Allgemein werden solche, die Fluoreszenzintensitọt verringernden Pro- zesse, als Fluoreszenz-Lửschung (engl. quenching) bezeichnet, wobei die zur Lửschung fỹhrenden Prozesse sehr unterschiedlich sein kửnnen. In verdỹnnten Lửsungen họngt die Fluoreszenzintensitọt linear von der Anzahl der angeregten Fluorophore ab. Bei hửheren Konzentrationen gilt diese Linearitọt nicht mehr, unter anderem daher, dass sich in die- sem Fall die Wahrscheinlichkeit erhửht, dass angeregte Molekỹle kollidieren und ein strah- lungsloser Energieỹbergang auftritt, der die Fluoreszenzintensitọt reduziert [80,156]. In diesem Fall spricht man von der Fluoreszenz-Selbstlửschung (engl. self-quenching). Aber auch andere in der Lửsung bendlichen Molekỹle sind in der Lage, durch Kollision mit an- geregten Fluorophoren diese in den Grundzustand zu versetzen. Solche Moleküle werden als quencher bezeichnet. Typische Fluoreszenz-Lửscher sind zum Beispiel molekularer Sauersto, Halogenide, Amine oder Elektronen-deziente Moleküle wie Acrylamid [106].
In beiden beschriebenen Fọllen, der Lửschung und Selbst-Lửschung, werden die kolli- dierenden Molekỹle strukturell nicht verọndert. Strukturelle molekulare Verọnderungen kửnnen die Fluoreszenzintensitọt selbstverstọndlich auch verringern, allerdings handelt
es sich dabei um dauerhaftes Fluoreszenz-Lửschen, da der Fluoreszenz-Lửscher den Fluo- rophor im Grundzustand beeinusst und keine diusiven Prozesse oder molekulare Kol- lisionen ausschlaggebend sind.
Ein Spezialfall der Selbstlửschung ist die Excimerbildung. Die Bezeichnung Excimer lei- tet sich aus der Kurzform von "excited dimer" (angeregtes Dimer) her. Denitionsgemọÿ besteht das Excimer-Molekül aus zwei oder mehreren Molekülen der gleichen Art. Die Besonderheit gegenüber einem normalen Molekül besteht darin, dass das Excimer nur gebildet werden kann, wenn ein Molekül im angeregten Zustand (M)* mit dem gleichen Molekỹl im Grundzustand (M) zusammen stửÿt:1M∗+1M 1 (M M)∗. Die ĩberschus- senergie des einen Partners wird auf beide Molekỹle zu gleichen Teilen verteilt. Vửllig analog zur Resonanzstabilisierung kovalenter Bindungen kommt es aufgrund der quanten- mechanischen Verteilung der Energie von einem auf zwei Moleküle zur Energieabsenkung.
Verliert dieses Excimer seine Anregungsenergie, trennen sich die Bindungspartner und kehren in den Grundzustand zurück [168]. Dabei wird die emittierte Energie des Exci- mers immer bei hửheren Wellenlọngen detektiert als die des Monomers. Im Grundzustand haben die vormaligen Bindungspartner eine abstoÿende Wechselwirkung miteinander.
Die Excimerbildung ist ein konzentrationsabhọngiger und durch Diusion kontrollierter Prozess. Die Bildungspartner mỹssen wọhrend des Anregungszustandes eines Molekỹls miteinander durch Zusammenstoÿen in Kontakt treten kửnnen. Die Wahrscheinlichkeit einer Excimerbildung ist umso hửher, je hửher die Monomerkonzentration und dement- sprechend kỹrzer der Diusionsweg ist. Excimer-bildende Fluorophore werden họug als Sensoren fỹr Verọnderungen in der Fluorophorkonzentration oder in der molekularen Pa- ckung der Umgebung verwendet. Viele aromatische Hydrokarbone wie Naphtalen oder Pyren sind excimerbildende Fluorophore. Der in der vorliegenden Arbeit họug ver- wendete Fluorophor Bodipy ist ebenfalls ein potenzieller Excimer-Bildner. Die konzen- trationsabhọngige Emissionsverschiebung wurde dabei erstmals von Pagano 1991 be- schrieben [131]. Paganos Arbeit leitete den Grundstein für weitere zellbiologische Un- tersuchungen ein, bei denen konzentrationsabhọngige Emissionsverschiebungen Rỹck- schlüsse auf die Verstowechslung und Anreicherung bioaktiver Moleküle schlieÿen lieÿen [34,118,130,181]. Abbildung 2.8zeigt die konzentrationsabhọngige Zunahme der Exci- meremissionen von Bodipy FL [118].
Der generelle Mechanismus, welcher zur Excimer-Bildung führt, ist noch nicht eindeutig geklọrt und die Bildung von Grundzustand-Dimeren wird in dieser Arbeit nicht weiter erlọutert.
Abbildung 2.8: Fluoreszenz-Emissionsspektra von Liposomen (Grundlipid hierbei POCP), welche unterschiedliche Mengen Bodipy-Ceramid enthalten. Mit hửherer Bodipy-Ceramid Konzentration verschiebt sich das bei 2 mol % ausschlieÿlich bei 515 nm auftretende Maximum sukzessive zu einem zwei- ten und bei 50 mol % ausschlieÿlich auftretendem Maximum bei 620 nm.
(Verọndert nach Marks et al. 2008 [118]) 2.5.1.3 Photobleichen und Phototoxizitọt
Neben den zuvor beschriebenen Mechanismen, welche zu unerwỹnschten Intensitọtsver- lusten bei uoreszenzmikroskopischen Untersuchungen fỹhren kửnnen, sind Photoblei- chen (engl. photobleaching) und Phototoxizitọt zwei insbesondere in zellbiologischen Ex- perimenten unerwỹnschte Phọnomene. Beiden liegt der gleiche Prozess zu Grunde, nọm- lich der Bildung reaktiver Sauerstomoleküle als Ergebnis intensiver Lichtbestrahlung.
Beide Phọnomene lassen sich bei uoreszenzmikroskopischen Analysen nicht gọnzlich ver- meiden, kửnnen aber durch genaue Kenntnis des Fluorophores, der Probe als auch der mikroskopischen Einstellungen minimiert werden.
Unter anderem ist die primọre Ursache beider Phọnomene eine licht-induzierte Bildung von Singulett-Sauersto (1O2) 2durch angeregte Fluorophore zu sein [53,159, 47]. 1O2 ist ein hoch-reaktives Molekỹl mit einer Lebensdauer von circa 4 às in Wasser, wobei diese Zeitspanne in Zellen aufgrund der Vielzahl an potenziellen Reaktionspartnern auf
< 0,5 às verkỹrzt wird. Daher wird der Interaktionsradius in Zellen auf < 50 nm verkỹrzt.
Letztendlich hat eine Reaktion von 1O2 mit Fluorophoren eine irreversible Zerstửrung
2Sauersto besitzt zwei unterschiedliche angeregte Zustọnde, die beide eine deutlich grửÿere Energie als der Grundzustand besitzen. Bei beiden Zustọnden sind die Spins der Elektronen entgegen der Hund'schen Regel antiparallel ausgerichtet. Der stabilere angeregte Sauersto wird nach der quan- tenmechanischen Bezeichnung für diesen Zustand auch Singulett-Sauersto (1O2) genannt.
des konjugiertenπ- Elektronensystems und damit den Verlust der Fluoreszenz zur Folge [133]. Um diesen Eekt mửglichst gering zu halten, kann die Anregungsintensitọt der Lichtquelle so niedrig wie mửglich eingestellt werden. Weiterhin zeigen unterschiedliche Fluorophore in Abhọngigkeit von ihrer Struktur mehr oder weniger starke Photobleich- Eekte bei gegebener Anregungsleistung [90], wodurch ein mửglichst bleich-stabiler Fluo- rophor zu bevorzugen ist.
Ein weiterer negativer Aspekt des Auftretens von 1O2 bei Lebendzellexperimenten ist die Phototoxizitọt. Bei diesem Prozess, welcher mit dem Auftreten von Photobleichung unweigerlich einhergeht, werden zum Beispiel Proteine, Nukleinsọuren oder andere zellu- lọren Strukturen beschọdigt oder zerstửrt. Auch hier ist der eektive Wirkradius des1O2 rọumlich stark eingeschrọnkt [64]. Dennoch kann Phototoxizitọt erhebliche Auswirkungen auf zellulọre Prozesse und Funktionen haben. Die extremste Konsequenz groÿer Mengen
1O2ist der Zelltod, allerdings kửnnen auch weniger eindeutige Phọnomene auftreten, wie beispielsweise die lichtinduzierte Ausschỹttung intrazellulọren Calciums oder verminder- ter Zellteilungsraten[100], welche unbemerkt bleiben aber die Experimente maÿgeblich beeinussen kửnnen.
Die beschriebenen Phọnomene der Photobleichung und der Phototoxizitọt spielen in Le- bendzellexperimenten eine entscheidende Rolle und sind zum Beispiel durch die Wahl geeigneter Fluorophore, mửglichst niedrigen Anregungsintensitọten und mửglichst den gesamten Emissionsbereich abdeckenden Emissionsltern so gering wie mửglich zu hal- ten.
2.5.1.4 Fluorophor-Sọttigung
Der Eekt der Fluorophor-Sọttigung tritt dann auf, wenn sich ein nennenswerter Teil der Fluorophore in dem beleuchteten Bereich einer Probe bereits im angeregten Singulettzu- stand bende. Diese angeregten Molekỹle absorbieren Licht bei vửllig anderen Wellen- lọngen als solche im Grundzustand. Daher fỹhrt eine Erhửhung des Photonenusses zu keiner linearen Steigung der Emissionsrate und die Zahl der absorbierten Photonen bleibt bei hohen Laserleistungen konstant. Insbesondere Proben unter konfokalen Mikroskopen, welche mit einer eektiven Laserstọrke von mehr als einem mW arbeiten, sind davon be- troen. Zusọtzlich ndet die Sọttigung von Fluorophoren hauptsọchlich in der Mitte eines fokussierten Laserstrahls statt, wodurch relativ mehr Signal von den Rọndern des angeregten Bereichs produziert wird. Das Signal wird somit durch Sọttigung verfọlscht und stellt kein Abbild der tatsọchlichen Farbstokonzentration mehr dar [133]. Zusọtz- lich fỹhrt die Fluorophor-Sọttigung auch zu einer Verschlechterung der axialen Auửsung eines konfokalen Mikroskops [173]. Analog zur Vermeidung des Photobleichens und der Phototoxizitọt lọsst sich auch die Fluorophor-Sọttigung durch mửglichst niedrige Anre-
gungsintensitọten vermeiden, beziehungsweise gering halten.