Um die Voraussetzungen für eine Fusion mit der PM bei bestimmten Liposomen, welche aus neutralen, positiv geladenen sowie uoreszenzmarkierten Lipiden bestehen, genauer
denieren zu kửnnen, wurden unterschiedliche, positiv geladene Liposomen-Typen her- gestellt. Zum einen wurde die Kopfgruppe des Helferlipids variiert, indem Phosphoetha- nolamin (PE)-Lipide gegen Phosphatidylcholin (PC)-Lipide ausgetauscht wurden. Wei- terhin wurde die Sọttigung der Fettsọurekette verọndert, indem einfach oder mehrfach ungesọttigtes Lipide mit gesọttigten Lipiden verglichen wurden. Der Einuÿ des positiv geladenen Lipids wurde untersucht durch den Austausch von einem positiv geladenen Phospholipid (DOEPC ) gegen ein synthetisches Ester- (DOTAP) oder Eter- (DOTMA) Lipid. Letztendlich wurde der Einuss der uoreszenzmarkierten Lipide getestet. Hier wurde das kopfmarkierte Bodipy FL-DHPE durch das kettenmarkierte β-Bodipy C12- HPC sowie das synthetische, amphipatische DiIC18(7) ersetzt.
4.2.3.1 Variation in der Kopfgruppe des neutralen Helferlipids
Um den Einuss der Kopfgruppe des neutralen Helferlipids auf die Fusionsfọhigkeit be- stimmter Liposomen untersuchen zu kửnnen, wurden Liposomen aus neutralen Lipiden mit unterschiedlichen Kopfgruppen hergestellt. Die getesteten neutralen Helferlipide wa- ren DOPE, DMPE,, DAPC, DMPC oder DPPC. Diese wurden jeweils mit den drei unterschiedlichen, positiv geladenen Lipiden DOEPC, DOTAP oder DOTMA kombi- niert sowie jeweils mit Bodipy FL-DHPE, β-Bodipy C12-HPC oder DiIC18(7) getestet.
Im folgenden werden nur die charakteristischen Liposomen folgender Zusammensetzung besprochen:
DMPC/DOTAP/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol) DMPE/DOTMA/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol)
Derartige Liposomen wurden mit adhọrenten CHO-K1 Zellen inkubiert, mit dem cLSM mikroskopiert und die selben Proben durchusszytometrisch untersucht. Abbildung 4.4 zeigt die Fluoreszenzintensitọt, aufgenommen mit dem Durchusszytometer sowie in Mi- kroskopaufnahmen. DMPC-haltige Liposomen wurden von den adhọrenten Zellen en- dozytosich aufgenommen. Im Durchusszytometer sowie dem cLSM war ein deutliches Signal im Excimer-Kanal erkennbar. Dagegen war das Monomersignal schwọcher und keine homogen gefọrbte Membran erkennbar. Liposomen mit DMPE als neutrales Li- pid konnten hingegen mit der PM fusionieren. Das Monomersignal war ausgeprọgter (Durchusszytometer sowie cLSM) und homogen gefọrbte Membranen waren in Mikro- skopaufnahmen erkennbar.
Abbildung 4.4: ĩberblick ỹber die Signalverteilung im Durchusszytometer (obere Rei- he; logarithmische Auftragung Bodipy-Monomer- gegen Excimersignal) sowie im cLSM (mittlere und untere Reihe, ebenfalls Monomer und Excimer) positiv geladener Liposomen nach Inkubation mit adhọren- ten CHO-K1 Zellen. DMPC -haltige Liposomen (linke Spalte) wurden, wie in den cLSM-Kanọlen zu sehen, endozytotisch aufgenommen. Im Durchusszytometer sowie auf Mikroskopaufnahmen war ein hohes BFL- Excimersignal detektierbar. DMPE-haltige Liposomen fusionierten mit der PM adhọrenter Zellen, wodurch diese ein homogenes Fluoreszenzsi- gnal im cLSM und ein stọrkeres Monomer-Signal im Durchusszytometer zeigten. Das Excimersignal war im cLSM-Bild fast nicht vorhanden und im Durchusszytometer deutlich schwọcher. Die blauen Zahlen geben die Anteile der detektierten Zellen in den einzelnen Sektoren in Prozent an.
Alle Aufnahmen wurden mit gleichen Gerọteeinstellungen gemacht. Maÿ- stab 25 àm
Weitere Phosphocholine, wie DPPC oder DAPC wurden ebenfalls getestet, verhinderten
aber wie DMPC eine Membranfusion (nicht gezeigt). Diese konnte nur bei DMPE- oder DOPE-haltigen Liposomen beobachtet werden.
4.2.3.2 Variation in der Kettensọttigung des Helferlipids
Der Einuss der Kettensọttigung des neutralen Lipids wurde durch systematischen Aus- tausch des gesọttigten DMPCs oder DPPCs durch ein ungesọttigtes DOPE und mehrfach ungesọttigtes DAPC untersucht. Die Liposomen wurden mit adhọrenten Zellen inkubiert, wobei die reprọsentativen Ergebnisse mit Liposomen folgender Zusammensetzung gezeigt werden:
DAPC/DOTAP/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol) DMPC/DOTAP/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol)
Abbildung4.5 zeigt den Einuss der Kettensọttigung des neutralen Lipids. Im Fall des gesọttigten DMPCs und der damit hergestellten Liposomen war nur eine endozytotische Aufnahme zu erkennen. Dies zeigte sich an den relativ hohen Excimersignalen in cLSM- Aufnahmen und im Durchusszytometer. Eine mehrfach ungesọttigte Fettsọurekette im Fall der DAPC-haltigen Liposomen hatte keinen positiven Einuss auf die Membranfu- sion. Weder im cLSM noch im Durchusszytometer konnten die für eine Membranfusion typischen Intensitọtsmuster beobachtet werden.
Als gesọttigte Lipide wurden des Weiteren Phosphoethanolamin-Lipide (wie DOPE oder DMPE) und DPPC (nicht gezeigt) getestet. Es konnte wie in Kapitel4.2.3.1beschrieben nur bei DMPE- und DOPE-haltigen Liposomen eine Membranfusion beobachtet werden.
Abbildung 4.5: ĩberblick ỹber die Signalverteilung im Durchusszytometer (obere Rei- he; logarithmische Auftragung Bodipy-Monomer- gegen Excimersignal) sowie im cLSM (mittlere und untere Reihe, ebenfalls Monomer und Exci- mer) positiv geladener Liposomen, bei denen das Helferlipid entweder ge- sọttigt (DMPC) oder mehrfach ungesọttigt (DAPC) war. In Mikroskop- Aufnahmen sowie Analysen mit dem Durchusszytometer der DMPC- haltigen Liposomen zeigte sich, dass diese nur endozytotisch aufgenom- men wurden. Dies war an dem relativ starken Excimer-Signal bei den cLSM- sowie durchusszytometrischen Analysen zu erkennen. DAPC- haltige Liposomen zeigten hingegen keinerlei zellulọre Aufnahme. Die blauen Zahlen geben die Anteile der detektierten Zellen in den einzelnen Sektoren in Prozent an. Alle Aufnahmen wurden mit gleichen Gerọteein- stellungen gemacht. Maÿstab 25 àm
4.2.3.3 Variation des positiv geladenen Lipids
Der Einuss des positiv geladenen Lipids auf die potentielle Fusionsfọhigkeit der Liposo- men wurde durch Austausch von DOTAP gegen DOEPC sowie DOTMA getestet. DOPE wurde als neutrales Helferlipid verwendet sowie die uoreszenzmarkierten Lipide Bodipy FL-DHPE,β-Bodipy C12-HPC und DiIC18(7). Es werden die reprọsentativen Ergebnisse folgender Liposomen-Zusammensetzung gezeigt:
DOPE/DOEPC/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol) DOPE/DOTAP/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol) DOPE/DOTMA/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol)
Abbildung4.6 zeigt den Einuss unterschiedlicher, positiv geladener Lipide auf die Fu- sionsezienz. Das DOEPC besaÿ die niedrigste Fusionsezienz. Zwar fusionierten, wie im cLSM-Monomerkanal zu sehen, einige Liposomen mit den Zellen, allerdings war die Fọrbung sehr schwach und viele unfusionierte Liposomen waren auf der Oberọche zu sehen. Die DOTAP-haltigen Liposomen zeigten eine hohe Fusionsezienz mit einer ho- mogen gefọrbten PM im Monomer-Kanal des cLSMs. Im Durchusszytometer wurde eine zweite, schwọcher (auf dem Niveau der DOEPC-Probe) markierte Fraktion deutlich. Das verwendete DOTMA besaÿ die beste Fusionsezienz aller drei getesteten, positiven Li- pide. Alle Zellen auf der Oberọche waren einheitlich homogen und stark markiert. Dies zeigte sich auch durch die groÿe Population mit hohem Monomer-Signal und gleichzeitig niedrigem Excimer-Signal bei der durchusszytometrischen Analyse. Gleiche Ergebnisse wurden auch bei Verwendung des kettenmarkiertenβ-Bodipy C12-HPC und des synthe- tischen, amphipatischen DiIC18(7) erzielt.
Abbildung 4.6: ĩberblick ỹber die Signalverteilung im Durchusszytometer (obere Rei- he; logarithmische Auftragung Bodipy-Monomer- gegen Excimersignal) sowie im cLSM (mittlere und untere Reihe, ebenfalls Monomer und Exci- mer) positiv geladener Liposomen, bei denen die positiv geladenen Lipide variiert wurden. Generell waren alle drei Liposom-Varianten zur Mem- branfusion fọhig, allerdings mit deutlich unterschiedlicher Ezienz. DO- EPC -haltige Liposomen zeigten das schwọchste Fusionspotenzial mit vie- len, unfusionierten Liposomen auf der Zelloberọche und dem schwọchs- ten Monomer-Signal im Durchusszytometer. DOPE-haltige Liposomen fusionierten ezient mit der PM adhọrenter Zellen. In der durchuss- zytometrischen Analyse ist weiterhin zu sehen, dass einige Zellen nicht sonderlich stark markiert waren. DOTMA-haltige Liposomen zeigten die stọrkste Fusionsezienz. Fast alle auf der Oberọche bendlichen Zellen waren sehr stark markiert. Die blauen Zahlen geben die Anteile der detek- tierten Zellen in den einzelnen Sektoren in Prozent an. Alle Aufnahmen wurden mit gleichen Gerọteeinstellungen gemacht. Maÿstab 25 àm
4.2.3.4 Variation des uoreszenzmarkierten Lipids
Das in den vorherigen Versuchsteilen verwendete, kopfmarkierte Bodipy FL-DHPE wurde gegen das kettenmarkierte β-Bodipy C12-HPC sowie das synthetische, amphipatische DiIC18(7) ausgetauscht, um den Einuss des Fluorophors beziehungsweise seiner Position untersuchen zu kửnnen. Dazu wurden folgende Liposomen hergestellt:
DOPE/DOTAP/β-Bodipy C12-HPC = 1/1/0,1 (mol/mol) DOPE/DOTAP/Bodipy FL-DHPE = 1/1/0,1 (mol/mol)
DOPE/DOTAP/DiIC18(7) = 1/1/0,1 (mol/mol)
Abbildung4.7zeigt die Ergebnisse der durchusszytometrischen und cLSM-Analyse nach Inkubation adhọrenter Zellen mit den verschiedenene Liposom-Typen. Alle drei geteste- ten Varianten waren zur Membranfusion fọhig. Das kettenmarkierte sowie das kopfmar- kierte Phospholipid zeigten im Durchusszytometer annọhernd gleich hohe Fluoreszenz- signale im Monomer-Kanal. Das kopfmarkierte Bodipy FL-DHPE besaÿ hingegen ein etwas stọrkeres Excimersignal. Die mikroskopischen Aufnahmen unterschieden sich al- lerdings hinsichtlich der Signalintensitọt. So war die mit dem kettenmarkierten Lipid inkubierte Probe etwas schwọcher uoreszent. In den durchusszytometrischen Analysen waren bei dem ketten- sowie kopfmarkierten Lipid zwei Zellpopulation zu sehen, welche sich hinsichtlich ihrer Monomer-Intensitọt unterschieden.
Da DiIC18(7) keine Excimere bildet, wurde der langwellige Kanal gegen die Vorwọrts- treuung aufgetragen. Es zeigte sich, dass fast alle Zellen mit Liposomen fusioniert werden konnten. Die Signalverteilung war allerdings deutlich breiter als bei den bisher verwen- deten Liposom-Arten, welche Membranfusion zeigten.
Abbildung 4.7: ĩberblick ỹber die Signalverteilung im Durchusszytometer (obere Rei- he; logarithmische Auftragung Bodipy-Monomer- gegen Excimersignal) sowie im cLSM (mittlere und untere Reihe, ebenfalls Monomer und Ex- cimer) positiv geladener Liposomen, bei denen die uoreszenzmarkierten Komponenten variiert wurden. Liposomen mit einem kettenmarkierten Lipid (linke Spalte) und mit einem kopfmarkierten Lipid (mittlere Spal- te) waren ebenso zur Membranfusion fọhig wie Liposomen aus einem syn- thetischen, amphipatischen Molekül (rechte Spalte). Da DiIC18(7) kei- ne Excimere bildet, wurde hier nur der infrarote Kanal analysiert. Die mit Bodipy FL-DHPE markierten Zellen zeigten ein etwas hửheres Exci- mersignal als die kettenmarkierte Probe. Im Durchusszytometer zeigten die beiden Monomer-Kanọle annọhernd gleich intensive Fluoreszenz. Die blauen Zahlen geben die Anteile der detektierten Zellen in den einzelnen Sektoren in Prozent an. Alle Aufnahmen wurden mit gleichen Gerọteein- stellungen gemacht. Maÿstab 25 àm