C. PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN
III. Ứng dụng của phương pháp giải trình tự gen
1. Ứng dụng:
Hiện nay, giải trình tự đang là xu thế phát triển và được ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực của công nghệ sinh học.
Phương pháp giải trình tự gen được ứng dụng để giải trình bộ gen của nhiều loài sinh vật. Là một trong những kỹ thuật chủ yếu được phát triển để nghiên cứu di truyền học, "xác định trình tự ADN" (DNA sequencing) cho phép các nhà nghiên cứu xác định trình tự nucleotide trên một đoạn ADN bằng phương pháp xác định trình tự gián đoạn chuỗi hiện nay là phương pháp được sử dụng phổ biến. Với kỹ thuật này, các nhà khoa học có thể nghiên cứu được những trình tự phân tử liên quan tới nhiều bệnh di truyền ở người.
Khi xác định trình tự đã trở nên đỡ tốn kém hơn,cùng với sự trợ giúp của các công cụ tính toán, những nhà nghiên cứu đã xác định được bộ gen của nhiều sinh vật bằng cách liên kết trình tự của nhiều đoạn khác nhau (quá trình này gọi là "lắp ráp bộ gen" -genomeassembly). Những kỹ thuật trên được sử dụng để xác định bộ gen người, đã được hoàn thiện trong Dự án Bản đồ gen Người vào năm 2003. Hiện nay khoảng 92% bản đồ gen đã được hoàn thành. Các DNA còn lại có độ trùng lặp lớn và không có dấu hiệu chứa gen, nhưng vẫn đợi tới khi xác đình hoàn toàn trình tự.
Từ khi có sự ra đời của kỹ thuật PCR thì kỹ thuật giải trình tự cũng có nhiều tiến bộ vượt bậc. Chỉ cần dùng PCR là có thể nhân bản đoạn gene muốn
giải trình tự thành hàng tỷ bản sao giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại này có thể đưa vào giải trình trực tiếp mà không phải chèn vào một plashmid giải trình tự nữa. Chính sự ra đời và hoàn thiện kỹ thuật PCR đã giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự không những trong vấn đề hoàn thiện nó mà cả trong vấn đề phạm vi áp dụng như:
Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu để so sánh một đoạn DNA bất kỳ với các dữ liệu trong ngân hàng gen có thể chúng ta xác định được đoạn ADN đó của sinh vật nào hay biết được trình tự sắp xếp các nucleotit của một đoạn DNA có thể suy ra trình tự các axit amin tương ứng trên mạch polypeptide nếu đoạn DNA đó mã hóa.
Phát hiện đột biến: sự sai khác về trình tự nucleotide trong cùng một sản phẩm gen, có ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa và ứng dụng thực tiễn.
Tạo ra các sinh vật mới mang những đặc tính mong muốn hoặc có thể chuyển gen vào các tế bào vi khuẩn, nấm men… để sản xuất sản phẩm gen theo con đường tái tổ hợp (protein, enzym, vaccine và các hợp chất có hoạt tính sinh học).
Ứng dụng kĩ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn.
Ứng dụng kĩ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm
Ứng dụng PCR và giải trình tự để phát hiện, định lượng và xác định Genotype HCV(virut viêm gan C)
Áp dụng PCR và giải trình tự để phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV(virut viêm gan B)
Áp dụng PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/ promoter và genotype HBV
PCR và giải trình tự phát hiện đột biến kháng Rifampicine và INH của M.
tuberculosis
Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm Chọn giống vật nuôi, cây trồng
Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn
Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân tử
Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm
Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…
2. Một số thành tựu:
Kết quả giải trình tự bộ gene người
Ngày 26/6/2000, tại Tòa Bạch Ốc với sự hiện diện của Tổng Thống HoabKỳ Bill Clinton, hai khoa học giaMỹ là Tiến Sĩ Crag Venter đại diện cho Celera Genomic và Tiến Sĩ Francis Collins đại diện cho HGP (HGP:
Human Genome Project) của NIH (NIH: National Institute of Health) công bố một cách long trọng là chương trình giải trình tự bộ gen người đã hoàn tất.
Thật sự cho đến thời điểm đó các nhà khoa học ở Công ty Celera Genomic hãy còn chưa giải trình tự được 3% bộ gen người, tức khoảng 150 triệu, và công việc này đòi hỏi phải từ 1 đến 2 năm nữa mới có thể hoàn tất vì 3% còn lại này nằm trên phần khó giải trình tự nhất.
Có thể tưởng tượng là nếu các trình tự của bộ gen người được in ra thành sách thì sẽ cần phải khoảng 200 cuốn và mỗi cuốn dày phải 500 trang.
Có 3000 trang nằm rải rác trong 200 cuốn sách trên là có ý nghĩa tức là có gen, mà cho đến hiện nay chỉ mới có một số ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa học đã đọc được tức là xác định được gen. Hãy còn vài trang (khoảng 3%) chưa viết xong và những trang này là những trang khó viết nhất vì thuộc những vùng khó giải trình tự nhất trong bộ gen người.
Cho đến tháng 4 năm 2003, các trang khuyết này đã được các nhà khoa học viết hoàn tất. Tuy vậy, một việc rất lớn hiện đang đặt ra trước mắt các nhà khoa học đó là phải xác định được các trình tự nào là gen và chức năng của các gen này. Chỉ có 3% của bộ gen người là mang gen tức là mang trình tự có ý nghĩa và hiện nay các nhà khoa học cũng chưa biết chính xác là thật sự có bao
nhiêu gen trong bộ gen người. Câu trả lời phỏng chừng nhất là từ 28.000 đến 140.000 gen, và gần đây nhất có lẽ là đang gần đến con số chính xác hơn, đó là 30.000 gen. Trong khoảng 30.000 gen này, các nhàkhoa học hiện chỉ biết được chức năng của khoảng 10.000 gen, hãy còn 20.000 chưa biết chức năng của chúng.
Sử dụng công nghê giải trình tự gen thế hệ mới nghiên cứu bệnh nhân tự kỷ - Phát hiện 2 đột biến mới trên gen RYR3 có liên quan đến kênh vận chuyển ion Ca2+
Ứng dụng công nghệ giải trình tự tại phòng thí nghiệm NK-Biotek:
+ Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn
→ Ứng dụng trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí:
Kết quả giải trình tự 16s rDNA trực khuẩn Gram [+] phân lập kị khí từ bệnh phẩm mũ xoang lấy từ bệnh nhân cho phép kết luận đây là Propionibacterium acnes
→ Phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản:
Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng trên người
→ Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng cho thủy sản
→ Một chủng vi khuẩn phân lập từ một sản phẩm probiotic nếu chi dựa vào tính chất khuẩn lạc và nhuộm Gram thì không thể biết đây không phải là B.
subtilis, nhưng khi giải trình tự 16s rDNA thì xác định được đây là B. cereus.
→Xây dựng lý lịch 16s rDNA của các chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn: Một kết quả định danh bằng PCR và giải trình tự 16s rDNA của một chủng vi sinh công nghiệp cho thấy đây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khuẩn rất khó định danh bằng vi sinh kinh điển
→Làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn
+ Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm
→ Phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm lấy ra từ phẫu thuật
bệnh nhân viêm xoang: kết quả phát hiện và định danh nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 28s rDNA trong các mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang trên bệnh nhân
→ Dịch vụ định danh vi nấm: Vi nấm có hình dạng vi thể hình hạt men như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99%.
+ Ứng dụng PCR và giải trình tự để phát hiện, định lượng và xác định genotype HCV
+ Áp dụng PCR và giải trình tự để phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV + Áp dụng PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/ promoter và genotype HBV
+ PCR và giải trình tự phát hiện đột biến kháng rifampicine và INH của M.
tuberculosis