Tốc ủộ cỏc phản ứng do enzyme xỳc tỏc phụ thuộc vào: nồng ủộ cơ chất và nồng ủộ enzyme, tính chất lý hoá của môi trường và các chất gây hiệu ứng.
3.5.1. Ảnh hưởng của nồng ủộ cơ chất và enzyme. ðộng học của phản ứng enzyme Tốc ủộ của phản ứng enzyme thường ủược xỏc ủịnh qua sự biến ủổi nồng ủộ cơ chất hoặc nồng ủộ sản phẩm của phản ứng, hoặc nồng ủộ coenzyme trong một khoảng thời gian với những ủiều kiện nhất ủịnh.
Brown (1902), Michaelis và Menten (1913) là những người ủầu tiờn nghiờn cứu vềủộng học của cỏc phản ứng enzyme. Họ ủó theo dừi vận tốc phản ứng thuỷ phõn ủường sucrose dưới tỏc dụng của enzyme sucrase ở những ủiều kiện khỏc nhau và thấy:
Hỡnh 3-12. Quan hệ giữa tốc ủộ phản ứng với nồng ủộ enzyme (a) và nồng ủộ cơ chất (b) - Nếu nồng ủộ cơ chất [S] khụng ủổi, thay ủổi nồng ủộ enzyme [E] thỡ tốc ủộ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ủộ enzyme. ðồ thị biểu diễn quan hệ này là một ủường thẳng (a).
- Ngược lại, khi [E] khụng ủổi, thay ủổi [S] thỡ tốc ủộ phản ứng phụ thuộc vào [S] theo ủường hyperbol (b).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… …… 61 ðểủơn giản hoỏ việc giải thớch sự liờn quan giữa tốc ủộ phản ứng enzyme và nồng ủộ cơ chất, Michaelis-Menten ủưa ra phương trỡnh thực nghiệm với giả thuyết là phản ứng chỉ cú một cơ chất và một sản phẩm ủược tạo thành. Nồng ủộ enzyme khụng ủổi, nồng ủộ phõn tử của cơ chất lớn hơn nồng ủộ phõn tử của enzyme rất nhiều.
Khi cơ chất (S) gắn với TTHð của enzyme (E) sẽ hình thành phức hợp trung gian enzyme-cơ chất (ES), sau ủú enzyme ủược giải phúng và tạo ra sản phẩm (P). Quỏ trỡnh của phản ứng cú thểủược khỏi quỏt như sau :
Trong ủú: k1 là hằng số vận tốc hỡnh thành phức hợp trung gian ES; k2 là hằng số vận tốc phõn ly ES và k3 là hằng số tốc ủộ hỡnh thành sản phẩm P.
Hằng số k2 nhỏ hơn rất nhiều so với k3, nờn tốc ủộ hỡnh thành phức hợp ES gần bằng tốc ủộ phõn giải ES thành sản phẩm và giải phúng enzyme.
Tốc ủộ hỡnh thành ES = k1.[E].[S] và tốc ủộ phõn ly ES = k2.[ES] +k3.[ES] = (k2 + k3).[ES].
Ở trạng thái cân bằng phản ứng thì k1.[E].[S] = (k2 + k3).[ES] (1) Nồng ủộ enzyme tự do [E] và nồng ủộ enzyme trong hợp chất trung gian [ES] thay ủổi, song tổng của chỳng luụn bằng nồng ủộ ban ủầu [Eo], nờn
[E] = [Eo] - [ES] (2)
Thay (2) vào (1) và qua một vài biến ủổi toỏn học ta cú:
k1[Eo][S]
[ES] =
k2 + k3+k1[S]
V0 = k3 [ES], cũn Vmax = k3[Eo]. Do ủú:
Trong phương trình (3), nếu Km = [S] thì V0 = Vmax/2
Phương trỡnh (3) ủược gọi là phương trỡnh Michaelis-Menten. Hằng số Km ủược gọi là hằng số Michaelis-Menten, là hằng số tổng hợp của cỏc hằng số tốc ủộ. Km chớnh là nồng ủộ cơ chất mà ởủú vận tốc phản ứng ủạt một nửa tốc ủộ tối ủa. Km chia ủồ thị ra làm hai vựng:
- Ở nồng ủộ cơ chất thấp, thấp hơn nhiều so với Km thỡ v ≈ Vmax.[S]/Km≈ k. [S]
tức là vận tốc phản ứng tỷ lệ với [S].
- Khi nồng ủộ cơ chất cao hơn nhiều so với Km thỡ v ≈ Vmax.[S]/[S] ≈ Vmax
Khi nồng ủộ cơ chất cao, vận tốc phản ứng tiến dần ủến tốc ủộ tới hạn.
Khỏc với Vmax, Km khụng phụ thuộc vào nồng ủộ enzyme mà phụ thuộc vào mụi trường (pH, nhiệt ủộ, cỏc chất gõy hiệu ứng, …), cho nờn sau số liệu Km cần thiết phải bổ sung ủiều kiện mà ở ủú Kmủó ủược xỏc lập. Hằng số Km ủặc trưng cho khả năng xỳc tỏc của một enzyme ủối với một cơ chất nhất ủịnh. ðối với ủa số enzyme, Km dao ủộng trong khoảng 10-1 – 10-6 mol.dm-3. Km càng thấp thì ái lực của enzyme với cơ chất càng cao. Khi biết được Km cĩ thểước đốn nồng độ cơ chất khi phản ứng ủạt tốc ủộ tối ủa, tớnh toỏn ủược vận tốc ban ủầu của phản ứng ở nồng ủộ cơ chất nhất ủịnh, hay ngược lại cú thể tớnh nồng ủộ cơ chất cần thiờt ủể phản ứng ủạt một vận tốc nào ủú.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… …… 62 Phương trỡnh Michaelis- Menten cũn cho thấy mối quan hệ giữa Vmax (tốc ủộ tới hạn) và hằng số vận tốc k3. Khi bóo hoà cơ chất, vận tốc phản ứng ủạt cực ủại (Vmax):
v = Vmax = k3.[Eo]
Nếu biết nồng ủộ Eo và từ giỏ trị vận tốc Vmaxủo ủược, cú thể tớnh ủược hằng số k3. Hằng số này sẽ cho biết hoạt tớnh phõn tử của enzyme (số phõn tử hay số mol cơ chất ủược 1 mol enzyme biến ủổi trong thời gian 1 giõy ởủiều kiện tối ưu).
Nồng ủộ cơ chất là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới hoạt ủộng xỳc tỏc của enzyme.
Trong cỏc phản ứng enzyme, khi nhiệt ủộ, pH, … ổn ủịnh thỡ tốc ủộ phản ứng phụ thuộc nồng ủộ enzyme và cơ chất của nú. Nếu nồng ủộ enzyme khụng ủổi, khi nồng ủộ cơ chất tăng thỡ tốc ủộ phản ứng sẽ tăng dần ủến tốc ủộ cực ủại (Vmax) và ủồ thị cú dạng hyperbol, như trong hỡnh 3- 12 (b). ðồ thị cho thấy tốc ủộ phản ứng khụng tăng theo ủường thẳng khi nồng ủộ cơ chất tăng dần. Ở những nồng ủộ cơ chất cao, tốc ủộ phản ứng tiến gần ủến tốc ủộ tới hạn (Vmax), nguyờn nhõn là tất cả enzyme sắp bóo hoà cơ chất. Núi cỏch khỏc, khi tất cả cỏc TTHð của enzyme ủó kết hợp với cơ chất thỡ dự cú tăng nồng ủộ cơ chất lờn bao nhiờu, tốc ủộ phản ứng cũng khụng tăng lờn ủược nữa.
Vmax và Km là hai hằng số cơ bản của mỗi enzyme mà cỏc nghiờn cứu cơ bản về enzyme ủều phải xỏc ủịnh. Vmaxủược xỏc ủịnh trờn ủồ thị Michaelis-Menten là dựa trờn một ủường tiếp tuyến với ủồ thị và Kmủược xỏc ủịnh từ một ủiểm trờn trục hoành tương ứng với ủiểm1/2Vmax. Vỡ vậy, những trị số tỡm ủược khụng chớnh xỏc. Thụng thường, phương trỡnh Michaelis-Menten ủược nghịch ủảo. Dạng nghịch ủảo này ủược gọi là phương trỡnh Lineweaver-Burk :
ðõy là nền tảng ủể dựng ủồ thị Lineweaver-Burk, cho phộp tỡm Km và Vmax dễ dàng và chính xác.
Hình 3-13. ðồ thị Lineweaver-Burk ðộng học của các phản ứng nhiều cơ chất:
Thường thì enzyme xúc tác cho phản ứng của 2 cơ chất và tạo ra 2 sản phẩm. Cơ chế diễn ra hơi khác so với phản ứng một cơ chất. Trước hết E kết hợp với một cơ chất (A), tao phức hơp EA. Nhờ sự thớch hợp cảm ứng tạo ra sự thay ủổi cấu hỡnh của tổ hợp, nờn EA→(EA)+, tạo ủiều kiện ủể phõn tử B ủược gắn vào, (ủối với enzyme tự do thỡ B cú ỏi lực thấp), hình thành tổ hợp EAB. Sau khi phản ứng tiếp tục xảy ra, tức là tổ hợp EAB biến thành EPQ (trong ủú P và Q là những sản phẩm), thỡ P rồi Q lần lượt sẽủược tỏch ra.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… …… 63 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt ủộ
Nhiệt ủộ là một trong cỏc yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng ủến hoạt tớnh của enzyme.
Bỡnh thường, tốc ủộ của phản ứng tăng khi nhiệt ủộ tăng. Chừng nào enzyme chưa bị biến tớnh, mỗi khi tăng 10°C, tốc ủộ phản ứng sẽ tăng 10 lần. Tuy nhiờn, khi nhiệt ủộ tăng ủồng thời cũng làm enzyme mất hoạt tính (vì apoenzyme biến tính và cofactor có thể bị tách ra).
Khi tăng nhiệt ủộ lờn khoảng 60-70°C, phần lớn enzyme mất hẳn hoạt tớnh và nhiệt ủộ này ủược gọi là nhiệt ủộ tới hạn. Chớnh vỡ hai hiện tượng trỏi ngược trờn mà mỗi enzyme cú một nhiệt ủộ thớch hợp (tối ưu) cho hoạt ủộng xỳc tỏc; ở nhiệt ủộủú phản ứng diễn ra nhanh nhất.
Hỡnh 3-14. Ảnh hưởng của nhiệt ủộ ủến hoạt tớnh xỳc tỏc của enzyme
Cỏc enzyme của ủộng vật mỏu núng hoạt ủộng tốt nhất xung quanh thõn nhiệt. Ở cỏc vi sinh vật chịu nhiệt, enzyme của chỳng cú nhiệt ủộ thớch hợp cao. Ở cỏc vi sinh vật cảm ứng, sống trong cỏc suối nước núng, nhiệt ủộ thớch hợp cú thể lờn ủến 90°C. Nhiều enzyme thực vật cũng cú nhiệt ủộ thớch hợp rất cao; chẳng hạn, papain hoạt ủộng mạnh nhất ở 80°C.
Nhiệt ủộ thớch hợp của một số enzyme khụng cố ủịnh, mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố (thời gian tỏc dụng, nồng ủộ enzyme, nồng ủộ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme).
Ở nhiệt ủộ thấp, hoạt ủộ xỳc tỏc của enzyme giảm. Hoạt ủộ của nhiều enzyme cũn khụng ủỏng kểở 0°C. Khi tăng nhiệt ủộ lờn, hoạt tớnh enzyme lại tăng theo.
3.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường
Cỏc enzyme thường rất nhạy cảm với pH của mụi trường, nờn pH cú ảnh hưởng rất nhiều ủến hoạt tính xúc tác của chúng. Hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào pH là do các nhóm chức cú thể bị phõn ly cho H+ở TTHð của enzyme hay của cơ chất qui ủịnh; phản ứng của enzyme và cơ chất phụ thuộc khả năng tách proton của các nhóm chức này.
(a) (b)
Hình 3-15. pH tối ưu của pepsin (a) và chymotrypsin (b)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… …… 64 Do ủú, phần lớn cỏc enzyme chỉ cú khả năng xỳc tỏc ở một khoảng pH nhất ủịnh, ngoài khoảng này, tốc ủộ xỳc tỏc sẽ giảm. Enzyme ủạt tốc ủộ xỳc tỏc cực ủại ở pH tối ưu. ða số cỏc enzyme cú pH tối ưu khoảng 5-7. Một số enzyme tiờu hoỏ lại hoạt ủộng tốt nhất ngoài khoảng này;
vớ dụ, pepsin hoạt ủộng tốt nhất khi pH vào khoảng 1,5-2, trypsin và chymotrypsin cú pH tối ưu khoảng 8-11. Ở một số enzyme, khoảng pH tối ưu khá hẹp, ở một số khác lại khá rộng. đôi khi pH tối ưu có thể khác và phụ thuộc vào loại cơ chất, ví dụ pH tối ưu ở các enzyme phân giải protein có thể thay ủổi phụ thuộc vào loại protein ủược phõn giải.
3.5.4. Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá và chất ức chế
Hiệu quả xỳc tỏc của enzyme bị ảnh hưởng bởi nhiều chất. Những chất ảnh hưởng ủến hiệu quả xỳc tỏc của enzyme ủược gọi là cỏc chất gõy hiệu ứng (effector). Chất gõy hiệu ứng làm tăng hoạt tớnh enzyme ủược gọi là chất hoạt hoỏ, chất làm giảm tỏc dụng của enzyme ủược gọi là chất ức chế.
Chất gõy hiệu ứng nội sinh cú thể là cỏc sản phẩm trao ủổi chất, cỏc coenzyme; ủõy là cỏc chất ủúng vai trũ quan trọng trong ủiều hoà trao ủổi chất của tế bào. Cỏc chất gõy hiệu ứng ngoại sinh cú thể là cỏc loại thuốc, cỏc chất ủộc cú tỏc dụng ức chế enzyme.
ðể cú thể hoạt ủộng, nhiều enzyme cần cỏcchất hoạt hoỏ (cú thể là ion kim loại, cỏc chất hữu cơ hay ủụi khi là cỏc anion như Cl-, -PO32-). Cỏc chất hoạt hoỏ thường khụng gắn cố ủịnh với enzyme (khụng phải là thành phần của enzyme hay là cỏc nhúm ghộp cốủịnh).
Các chất ức chế là những chất kìm hãm phản ứng enzyme, có bản chất khác nhau (ion, cỏc chất vụ cơ hay hữu cơ). Chỳng làm thay ủổi cấu trỳc phõn tử enzyme làm enzyme mất khả năng xỳc tỏc, hay cạnh tranh với cơ chất về TTHð làm giảm tốc ủộ phản ứng, hoặc là không làm enzyme bị biến tính nhưng làm cho phức hợp ES không thể tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme.
Hiện tượng ức chế enzyme khụng những là cụng cụủiều hoà của tế bào mà cũn cú rất nhiều ý nghĩa thực tiễn: y học, thú y (chống nhiễm trùng), trong nông nghiệp (sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng) và cả trong chiến tranh (các vũ khí hoá học).
Hình 3-16. Chất ức chế cạnh tranh gắn vào TTHð (a); chất ức chế không cạnh tranh gắn gắn vào vị trí khác, song chỉ gắn với phức hợp ES (b)
Ức chế enzyme là hiện tượng rất phổ biến trong ủời sống sinh vật. Trờn 90% cỏc hiện tượng trỳng ủộc là do sựức chế hoạt ủộng của cỏc enzyme. Nguyờn nhõn của hiện tượng này là do sự phong bế TTHð của các enzyme. Ví dụ: Các enzyme hô hấp (cytochrome) trong chuỗi hô hấp mô bào có nhúm ghộp là nhúm hem với nguyờn tử sắt cú thể biến ủổi hoỏ trị khỏ linh ủộng, thường xuyờn cho và nhận cỏc ủiện tử trong quỏ trỡnh vận chuyển ủiện tử. Khi ngộủộc HCN (cyanic acid) thỡ xảy ra phản
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ sinh ủại cương...……… …… 65 ứng kết hợp gốc CN- với nguyờn tử sắt ba tạo ra phức hợp bền vững (Fe+3-CN). Do ủú, khả năng trao ủổi ủiện tử của hệ thống cytochrome bị trở ngại, gõy hiện tượng ngạt từ cỏc mụ bào.
Cú thể phõn loại cỏc chất ức chế theo nhiều cỏch. Theo nguồn gốc, chỳng ủược phõn thành:
chất ức chế tự nhiờn và chất ức chế nhõn tạo. Theo tỏc dụng ủặc hiệu chỳng ủược phõn thành: chất ức chếủặc hiệu (ức chế một hay một số enzyme giống nhau) và chất ức chế khụng ủặc hiệu (ức chế nhiều enzyme, vớ dụ cỏc chất gõy biến tớnh enzyme). Theo cơ chế tỏc ủộng, cỏc chất ức chếủược chia thành: chất ức chế cạnh tranh và chất ức chế không cạnh tranh.
Chất ức chế cạnh tranh: không ảnh hưởng tới Vmax, nhưng làm tăng Km. Các chất ức chế cạnh tranh có cấu trúc (cả phân tử hay phần làm nhiệm vụ liên kết với enzyme) giống cơ chất, làm enzyme không nhận cơ chất, thay cho tạo phức hợp ES lại tạo phức hợp enzyme - chất ức chế (EI) khụng chuyển thành sản phẩm ủược; như vậy, enzyme bị phong bế. Phức hợp EI có thể có thể phân ly thuận nghịch thành E và I (chất ức chế). Nếu có cơ chất, thì cơ chất S và chất ức chế I sẽ cạnh tranh nhau về TTHð. Mức ủộức chế sẽ phụ thuộc vào tỷ lệ nồng ủộ 2 chất và ái lực của chúng với enzyme. Tác dụng ức chế có thể hoàn toàn bị loại bỏ khi nồng ủộ cơ chất ủược nõng cao. Chất ức chế cạnh tranh cũn cú thể cạnh tranh với cỏc coenzyme về trung tâm liên kết trên bề mặt phân tử enzyme.
Chất ức chế không cạnh tranh: không làm ảnh hưởng tới sự liên kết của enzyme với cơ chất, nhưng làm giảm tốc ủộ tạo ra sản phẩm. Cỏc chất ức chế này khụng ảnh hưởng tới hằng số Km, nhưng làm giảm tốc ủộ tối ủa của phản ứng. Tỏc dụng ức chế khụng phụ thuộc vào nồng ủộ cơ chất nờn khụng thể loại bỏ bằng cỏch tăng nồng ủộ cơ chất. Cỏc chất ức chế khụng cạnh tranh tỏc ủộng theo cơ chế gõy hiệu ứng dị khụng gian (allosteric effect).
3.6. CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME
Thời kỳ ủầu, khi enzyme học chưa phỏt triển, nhiều cơ chế hoỏ sinh cũn chưa sỏng tỏ, người ta thường gọi cỏc enzyme ủược phỏt hiện bằng những tờn riờng khỏc nhau, và tờn enzyme thường cú ủuụi "in". Cho ủến nay một số vẫn ủược dựng; vớ dụ: pepsin, trypsin, vv…
Sau ủú, cỏc enzyme thường ủược ủặt tờn bằng cỏch thờm ủuụi "ase" vào tờn cơ chất hay kiểu phản ứng; ví dụ: urease xúc tác sự thuỷ phân urê, DNA-polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA.
Số lượng enzyme tỡm ra ngày càng nhiều, ủũi hỏi phải ủược phõn loại và gọi tờn một cỏch thống nhất. Bên cạnh tên gọi thông thường, tiểu ban enzyme (EC) của Hội hoá sinh quốc tế (IUB) ủó thống nhất ủưa ra một hệ thống cho tờn gọi và phõn loại enzyme vào năm 1961. Tờn gọi và phõn loại thống nhất ủó ủược xem xột, cõn nhắc lại và bổ sung vào những năm 1964, 1972, 1978 và 1984.
Theo cỏch phõn loại này, cỏc enzyme ủược chia thành 6 lớp theo kiểu phảnn ứng mà enzyme xỳc tỏc và ủựợc ủỏnh số từ 1 ủến 6. Mỗi lớp lại ủược chia thành cỏc tổ, mỗi tổ lại chia thành cỏc nhúm.
Tờn enzyme gồm ba phần: phần thứ nhất là tờn cơ chất ủặc hiệu (nếu phản ứng cú hai cơ chất tham gia thỡ lấy tờn cả hai), phần thứ hai là tờn kiểu phản ứng, phần thứ ba là ủuụi ase. Như vậy, enzyme xúc tác cho cơ chất A nhờ dạng phản ứng R có tên là Arase; enzyme xúc tác phản ứng của chất A với chất B (hay cofactor B) nhờ phản ứng dạng R, có tên A:B-Rase. Ví dụ: tên hệ thống của enzyme xúc tác cho phản ứng ATP + Glucose → ADP + Glucose-6-phosphate là ATP:glucose phosphotransferase, chuyển nhóm phosphoryl từ ATP tới glucose.
Mỗi enzyme ủược ký hiệu bằng 4 chữ số: chữ số thứ nhất chỉ lớp, chữ số thứ hai chỉ tổ, chữ số thứ ba chỉ nhóm và chữ số thứ tư là của từng enzyme. Enzyme xúc tác cho phản ứng nêu trên có ký hiệu là EC. 2.7.1.1 là enzyme thuộc lớp 2, tổ 7, nhóm 1 và có số thứ tự là 1.
Trong thực tiễn, tờn thụng thường thường ủược sử dụng nhiều hơn. Enzyme cú ký hiệu nờu trờn ủược gọi là hexokinase. Tờn hệ thống chỉ hay ủược dựng khi giới thiệu enzyme.
Hệ thống phân loại quốc tế chia enzyme thành 6 lớp theo kiểu phản ứng, bao gồm: