Để đáiih giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp đuọc với hi vọng tìm thấy các dẫn chất mới thuộc dãy 5- n i t r o f u r f u r a l có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm.
2.4.1. Nguyên tắc:
Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm của các chất thử được xác định băng ky thuật khuếch tán trên môi trường thạch đặc theo quy định của Dược điển Việt Nam [4] sử dụng các khoanh giấy tẩm dung dịch chất thử. Khả năng kháng khuẩn kháng nấm được xác định bằng đường kính vòng ức chế vi sinh vật kiểm định.
2.4.2. Chuẩn bị mẫu thử.
Để thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được chúng tôi tiến hành thử ố nồng độ lmg/ml (pha trong dung mỏi DMF). Tác dụng kháng khuẩn kháng nấm được so sánh với Nitrofurantoin (NFT).
Các dung dịch thử được tẩm vào các khoanh giấy lọc vô trùng đường kính
6mm. Sau đó để khô tự nhiên cho bay hít dung môi ( tương dưong VỚI 50ng chất thử/ khoanh giấy).
2.4.3. Chủng vi sinh vật kiểm định.
Các vi sinh vật dùng trong nghiên cứu là các chủng quốc tế và một số chủng được phân lập ờ Việt Nam, nhận được từ Viện Kiểm nghiệm, Viện Vệ sinh dịch tê, Bọ y "chúng tôi đã sử dụng 4 chủng vi khuẩn Gram (+), 5 chủng vi khuẩn Gram (-
) và một chủng nấm gây bệnh.
- Các chủng vi khuẩn Gram (+):
Bacillus cereus Bacillus pumilus Bacillus subtilis Sarcina lutea
ATCC 9946 NCTC 8241 ATCC 6633 ATCC 9341
- Các chủng vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi
Shigella flexneri - Chủng nấm :
Candida albicans 2.4.4. Môi trường:
* Môi trường canh thang (MT1):
Pepton NaCl Cao thịt Nước vừa đủ:
* Môi trường Sabouraud lỏng (MT2):
Pepton Glucose Nước vừa đủ:
* Môi trường thạch thường (MT3):
Thạch Pepton NaCl Cao thịt Nước vừa đủ:
* Môi trường Sabouraud (MT4):
Pepton Glucose Thạch
Nước vừa đủ
ATCC 25922 BV 108 VM 201 DT 220 DT 112 ATCC 10231
0,5%
0,5%
0,3%
1%
2%
1,8%
0,5%
0,5%
0,3%
1%
2 %
1,6%
2.4.5. Tiến hành:
Các chủng vi sinh vật chỉ thị được cấy từ ống nghiệm giữ giống sang những ống nghiệm chứa sẵn lOml môi trường canh thang (MT1) ( đối với vi khuẩn) và môi
29
trường Sabouraud lỏng (MT2) ( đối với vi nấm). Nuôi cấy cho vi sinh vật phát triển từ 1 - 2 ngày để nhủ dịch vi khuẩn kiểm định có nồng độ ỈO7 -108 tế bào/ml.
Chuẩn bị môi trường kiểm định, môi trường thạch thuờng(MT3) và môi trườnơ Sabouraud (MT4) tiệt trùng latm/30 phút. Khi nhiệt độ môi trường hạ xuống 40 - 45°c dùng pipet vô trùng cấy giống vi sinh vật đã được chuẩn bị h trên vào môi trường, MT3 ( đối với vi khuẩn) và MT4 ( đối với vi nấm) vófi tỷ lệ thể tích thích hợp (2:80) lắc cho vi sinh vật phân tán đều. Cho vào các hộp petri vô trùng có đường kính như nhau mỗi hộp 20ml môi trường MT3 ( thử kháng khuẩn), MT4 ( thử kháng nấm) đã cấy vi sinh vật. Khi thạch nguội, đặt các khoanh giấy tẩm dung dịch chất thử theo sơ đồ quy định. Để các hộp petri ở nhiệt độ phòng 2-3 giờ cho chất thử khuếch tán vào môi trường. Sau đó nuôi cấy ở nhiêt độ 37°c trong thời gian 18-20 giờ.
Song song cùng điều kiện chúng tôi tiến hành với chất đối chiếu là nitrofurantoin (NFT).
Khả năng kháng khuẩn kháng nấm của các chất được xác định bằng cách đo vòng vô khuẩn. Kết quả được ghỉ bảng 6.
Bảng 6,Kếtquả thử tác dụngkháng khuẩn, kháng nấmcủa 7 chất(n ->VIII)nồng độlmg/ml (đường kínhvòngvôkhuẩntính bằng mm)
2.4.6. Kết quả và nhận xét:
Từ kết quả xác định vòng vô khuẩn ở bảng 6, chúng tôi có các nhận xét sau đây:
- Với nồng độ đã thử, 7 chất ( II -VIII) đều có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm rõ rệt trên tất cả các chủng vi sinh vật kiểm định.
- So sánh với nitrofurantoin, 7 chất ( II -VIII) đều có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hơn trên 10 chủng đã thử ở cùng nồng độ.
- So sánh tác dụng kháng khuẩn của 7 chất ( II -VIII) có thể thấy chúng đều có tác dụng ở các mức độ tương đương nhau, trong đó chất (II) có tác dụng mạnh trên 3 chủng (Bacillus subtilis , Escherichia coli, Proteus mirabilis), chất (III) có tác dụng mạnh ở 2 chủng Gram (+) (Bacillus cereus, Bacillus pumilus), chất (VI) tác dụng mạnh nhất trên 2 chủng (Sarcina lutea, Shigella flexneri).
- ỏ nồng độ đã thử 7 chất (II - VIII) đều có tác dụng mạnh với chủng nấm Candida albicans và mạnh hơn nitrofurantoin, chất (VI) có tác dụng mạnh nhất.
* Nhận xét sơ bộ về môi liên quan giữa cấu trúc và tác dụng.
Từ kết quả trên chúng tôi có nhận xét:
5- (5- nitro-2-furfuryliden)-thiazolidin - 2,4-dion (II) có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hơn nitrofurantoin. Điều đó chứng tỏ cấu trúc phân tử do ngưng tụ 5 - nitrofurfural với thiazolidin - 2,4-dion đã mang lại hoạt tính sinh học mạnh hơn cấu trúc phân tử do ngưng tụ 5 - nitrofurfural với 1- aminohydantoin. Từ đó có thể rút ra nhận xét: ngoài yếu tố cấu trúc chung là nhóm N 02 gắn vào vị trí 5 của nhân furan thì các nhóm thế gắn vào vị trí 2 của nhân furan có ảnh hưởng đên hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của phân tử. Trong phân tử chất (II) có nhóm ceton a,(3- ethylenic gắn vào vị trí 2 của nhân furan có lẽ nhóm này đã góp phần mang lại hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cao, như một số tài liệu khác đã công bố[8, 16].
- So sánh tác dụng kháng khuẩn , kháng nấm của 6 dẫn chất base Mannich (III-VIII) với chất (II) thì thấy việc đưa nhóm base Mannich vào vị trí 3 của chất(II) đã không ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm .
- Các nhóm thế khác nhau và vị trí khác nhau của chúng ở hợp phân amin thơm của các dẫn chất base Mannich (III-VIII) cũng không thấy ảnh hưởng rõ rệt
- Đáng chú ý là tác dụng kháng nấm Candida albicans mạnh của cả 7 chất (II-VIII). Trong; đó chất (VI) ( dẫn chất có hợp phần amin thơm là ortho cloroanilin)
có tác dụng mạnh nhất, từ đó có thể nhận xét nguyên tử Clo ở vị trí ortho của hợp phân amin của chất (VI) đã mang lại hoạt tính kháng nấm đáng chú ý.
33
Hình 15 .Vòng vô nấm của các chất II, IV, V, VI.
và mtrofurantoin(NFT) với chủng nấm Candida albicans ATCC 10231
Hình 16 Vòng vô khuẩn của các chất n, IV, V, VI, VII, vni
Hình 17 Vòng vỏ khuẩn của các chất II, IV, V, VI, vn, VIII
và nitrofurantoin(NFT) với chủng Sarcina lutea ATCC 9341.
Hình 18 Vòng vô khuẩn của các chất n, IV, V, VI, vn, vm
và nitrofurantoin(NFT) với chủng Bacillus pumilus NTCC 8241.
PHẦN 3