Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903.
Năm 1903 nhà bác học người Nga Txvet đã dùng cột nhôm oxit để tách các picmen của lá cây thành các chất riêng biệt. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký (chromatography). Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 26 Sắc ký là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động. Trên thế giới hiện nay là sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ, như silicagel, YMC, ODS, Al2O3 v.v…) còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc ký lỏng), hay chất khí (sắc kí khí). Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân cực hơn. Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân cực của dung môi như sau: ete dầu hoả, hexan, xiclohexan, cacbon tetraclorua, xylen, toluen, benzen, cloroform, metylenclorua, axeton, dioxan, etylaxetat, piridin, propanol, metanol, nước, axitaxetic.
Nguyên tắc căn bản được sử dụng trong phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ. Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hoả đến nước.Tuỳ thuộc vào các cách tiến hành sắc ký mà người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký như sau:
1.4.1 Sắc ký cột
Sắc ký cột là một phương pháp hiện đại, tinh vi để tách các cấu tử hoá học ra khỏi hỗn hợp của chúng. Nếu lựa chọn đúng các điều kiện, người ta có thể tách hầu hết các chất bất kì một hỗn hợp nào.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm:
- Lựa chọn chất hấp phụ.
- Sự lựa chọn dung môi giải li.
- Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp phụ, lượng mẫu chất được dùng.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 27 - Vận tốc giải li.
Chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion v.v…Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột thuỷ tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa ký thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa ký thuyết càng lớn, do đó khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trong một số trường hợp khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây nên hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D) rất quan trọng đồng thời nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tuỳ thuộc vào hệ số tách (tức là tuỳ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất), hệ số này dao động trong khoảng 1/20 đến 1/30.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 28 Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì người ta thường phải tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó đư lên cột. Nếu tách tinh, thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
+ Một là nhồi cột khô: Theo cách này, cột được đổ đầy dung môi, vừa cho dung môi chảy ra chầm chậm bên dưới, vừa cho từng ít một chất hấp phụ ở dạng khô vào đầu cột (dùng một tờ giấy lọc tròn xếp thành hình phễu đó có đục một lỗ nhỏ đủ cho bột khô bên trong phễu chảy thành dòng nhỏ xuống dung môi trong cột), vừa gõ nhẹ vào thành cột. Khi chất hấp phụ đạt đến chiều cao cần thiết trong cột thì ngưng không cho thêm nữa. Tiếp tục cho dung môi chảy ngang qua chất hấp phụ vài lần như mô tả ở phương pháp nhồi cột ướt.
+ Hai là nhồi cột ướt: Trong cách này, chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi chạy cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách. Do đó,yêu cầu cột không có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt gãy.
Tốc độ dòng chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Tuy
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 29 nhiên, nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài việc sử dụng SKLM để định hướng cho sắc ký cột, người ta còn sử dụng SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dầy hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng silicagel rồi giải hấp bằng dung môi thích hợp để thu hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch axit sunfuric 10%.