Cấu trúc hoá học của các hợp chất được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà người ta sử dụng các phương pháp phổ khác nhau. Cấu trúc càng phức tạo thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao.
Trong một số trường hợp, để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh…
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrated Spectroscopy).
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 30 ngoại. Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Chính vì vậy, việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp thụ cơ bản trên phổ, từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức) và rút ra kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong vùng 1020-1100 cm-1, của nhóm C=C trong khoảng 1630-1650 cm-1, N-H (3400-3500 cm-1), v.v…Đặc biệt, vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp. Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, đồng thời lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này (được nghiền và ép viên mỏng với KBr bằng máy ép thuỷ lực dưới áp suất khoảng 13-15 at) lại cần từ 2-3 mg và khó thu hồi lại. Chính vì vậy, thông thường đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân hay phổ khối lượng.
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)
Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí; tạo ra các ion phân tử và ion mảnh từ khí đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/ze) của chúng. Bởi vì e là điện tích của một electron, được lấy là 1, nên các ion có z > 1 là rất nhỏ, do đó tỷ số m/z thường chính là khối lượng của ion. Vì thế, phổ thu được có tên là phổ khối lượng viết tắt là phổ MS (Mass Spectroscopy).
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 31 Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc háo học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng. Những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrometry) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
+ Phổ EIS (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) gọi là phổ phun màu điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
+ Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nhanh ởnăng lượng thấp, do đó phổ cũng dễ thu được pic ion phân tử.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức của hợp chất hữu cơ.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 32 Phân tích phổ khối lượng là quy kết cho mỗi pic trên phổ một mảnh phân tử xác định và chỉ ra sự tạo thành ion mảnh đó, từ đó rút ra những kết luận về cấu tạo của phân tử.
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ. Phương pháp này đặc biệt hữu hiệu khi sử dụng thư viện phổ để so sánh, nhận dạng các hợp chất. Có thể sử dụng phương pháp sắc ký khí-khối phổ viết tắt là GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu trên cơ sở nối ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng.
Toàn bộ hệ thống GC- MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lí số liệu. Ngoài ra còn sử dụng phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ, viết tắt là LC-MS (Liquid Chromatogroply- Mass Spectrometry) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược). Ưu điểm của hệ thống LC- MS cũng giống như hệ thống GC-MS. ở hệ thống LC-MS người ta phải áp dụng những kĩ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc ký lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng.
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 33 Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin-spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
a) Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học () của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học cũng như các tác tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc háo học của hợp chất.
b) Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một từ trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Những pic có cường độ nhỏ tương ứng với nguyên tử cacbon không đính với hiđro, còn pic có cường độ lớn thì ứng với các nguyên tử cacbon đính với một hay nhiều nguyên tử hiđro. Thang đo cho phổ
13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).
c) Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 34 hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của Ch2 về một phía trên phổ DEPT 135. Còn trên phổ DEPT 90 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
Hiện nay việc đo phổ 13C đã đạt tới trình độ chính xác ± 0,01 ppm vì thế mỗi nguyên tử cacbon không tương đương trong phân tử đều cho một tín hiệu riêng, rất hiếm khi bị xen lấp bởi tín hiệu của nguyên tử cacbon khác sẽ giúp ta nhanh chóng xác định được bộ khung cacbon của phân tử, điều đó rất quan trọng trong việc xác định cấu trúc phân tử.
d) Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
+ Phổ HMQC: (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C- NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
+ Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) 1H-1H Chemical shift Correlation Spectroscopy
Phổ này biểu diễn các tương tác H-H, chủ yếu các proton đính với cacbon liền kề nhau. Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử.
Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 35 + Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE deffrences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về mặt không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn.
Ngày nay người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ hai chiều rất hiện đại khác ví dụ như kỹ thuật xoá tương tác trên các phổ nhất định (decoupling), ví dụ như trên phổ proton, xoá tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác đinh được vị trí của các proton bên cạnh.
v.v...
Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử. Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế, bởi vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn phải sử dụng kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 36 đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh bằng LC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
Nguyễn Thị Lương K30A - Khoa Hoá Học 37