2.1 Nội dung nghiên cứu
Đánh giá khả năng phòng, trừ bệnh của một số vi khuẩn đối kháng đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên hạt trong điều kiện phòng thí nghiệm
và nhà lưới.
Khảo sát khả năng phòng trừ bệnh héo xanh của một số phương pháp phòng trừ bệnh trong điều kiện nhà lưới.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến thang 11 năm 2023
Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật và trại
thực nghiệm khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
2.3 Vật liệu thí nghiệm
Hạt giống cà chua F1 siêu kháng bệnh PN — 209, cơ sở hạt giống Phú Nông Các vi khuẩn do phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật cung cấp
Bảng 2.1 Danh sách các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu
STT Kí hiệu Định danh băng đặc điềm hình thái và sinh hóa
1 CXT3 Ralstonia solanacearum 2 DxTI Klebsiella pneumoniae 3 CC-LD2.2 Actinobacteria
4 ĐXT6 Bacillus amyloliquefaciens 5 ĐHTI Enterobacteriaceae
Các vi khuẩn được kiệt kê ở Bảng 2.1 được sử dụng nghiên cứu dựa trên kết quả của (Đặng Thị Huỳnh Như, 2022) với đề tài “Danh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ Cà”.
Với khảo sát 6 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng bằng phương pháp đục lỗ thạch thì có 4 dòng không gây độc tinh cho cây là CC-LD 2.2, DXT1, DXT6, ĐHTI. Vì thế các dòng vi khuẩn này tiếp tục được đánh giá khả năng phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cả
chua.
2.3.1 Dụng cu thiết bị
Dung cu: dia petri (đường kính 90 mm), bình tam giác thủy tinh (250 ml), pipet,
thước do, que cấy, đèn côn, giấy lọc
Thiết bị máy móc: tủ cấy khử trùng (IIAC2 - 4E8, Esco, Singapore), nồi hấp khử
trùng (MS40L, ALP, Japan), cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), máy Nano VueTM Plus (SCIE-PLAS LTD, Biochrom, Anh), máy lắc (SSLI, Stuart, Anh), máy lắc Vortex — ZX3 (Velp, Y).
2.3.2 Hóa chat và thành phan môi trường
Hóa chất: cồn 70°, cồn 96°, agar, peptone (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), cao nắm men (Việt Nam)
Thành phần môi trường
Môi trường LB: 10 g peptone, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước cất
1000 ml
Môi trường WA: agar 20 g, nước cất 1000 ml
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Đánh giá khả năng phòng trừ của một số vi khuẩn đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt trong điều kiện phòng thí nghiệm
Chuẩn bị
Hạt giống cà chua được ngâm trong cồn 70° trong 30 giây sau đó rửa hạt lại bằng nước cất. U hạt trên giấy thấm vô trùng được làm ẩm trong dia petri.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
Dịch vi khuẩn héo xanh và dịch vi khuẩn đối kháng: được nhân nuôi trong môi trường LB lỏng trong 36 giờ. Do mật độ vi khuẩn với máy do mật độ, điều chỉnh mật độ đến 10° CFU/ml.
Phuong pháp thực hiện
Thí nghiệm được thực hiên theo phương pháp của Silva và ctv (2003) có cải tiến Thí nghiệm phòng bệnh: khi hạt nảy mầm, ngâm hạt vào dịch vi khuẩn đối kháng đã được chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, sau đó ngâm hạt vào dich vi khuân bệnh trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, cấy hạt trên một đường thăng với khoảng cách bằng nhau vào đĩa petri chứa sẵn môi trường WA (mỗi đĩa 10 hạt). Và đặt ở nhiệt độ phòng.
Thí nghiệm trừ bệnh: khi hạt nảy mầm, ngâm hạt vào dich vi khuẩn bệnh đã được chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, sau đó ngâm hạt vào dich vi khuẩn đối khang trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, cay hạt trên một đường thang với khoảng cách bằng nhau vào đĩa petri chứa sẵn môi trường WA (mỗi đĩa 10 hạt), đặt ở nhiệt độ phòng.
Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 4 dòng vi khuẩn. Với 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức là 3 LLL, mỗi LLL là 1 dia petri gồm 10 hạt, trong đó có 4 nghiệm thức với mỗi nghiệm thức là 1 dòng vi khuẩn, 1 nghiệm thức xử lý nước cat, 1 nghiệm thức xử lý vi khuan bệnh và 4 nghiệm thức chi xử lý vi khuẩn đối kháng tương ứng với 4 dòng vi khuẩn,
Thí nghiệm phòng bệnh
NTI: Ngâm hạt với vi khuẩn DXT1 30 phút, sau đó ngâm với vi khuan gây bệnh
CXT3 30 phút
NT2: Ngâm hạt với vi khuẩn CC — LD 2.2 30 phút, sau đó ngâm với vi khuan gây
bệnh CXT3 30 phút
NT3: Ngâm hat với vi khuân DXT6 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn gây bệnh
CXT3 30 phút
NT4: Ngâm hạt với vi khuẩn ĐHTI 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn gây bệnh
CXT3 30 phút
NTS: Ngâm hạt với vi khuan gây bệnh CXT3 30 phút NT6: Ngâm hạt với nước cất
NT7: Ngâm hạt với vi khuẩn DXT1 30 phút
NTS: Ngâm hạt với vi khuân CC - LD 2.2 30 phút NT9: Ngâm hat với vi khuân ĐXT6 30 phút
NT10: Ngâm hạt với vi khuân ĐHTI 30 phút
Thí nghiệm trừ bệnh
NT1: Ngâm hạt với vi khuân CXT3 trong 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn ĐXTI
30 phút
NT2: Ngâm hạt với vi khuẩn CXT3 30 phút, sau đó ngâm với vi khuân CC — LD
2.2 30 phút
NT3: Ngâm hạt với vi khuẩn CXT3 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn DXT6 30
phút
NT4: Ngâm hạt với vi khuẩn CXT3 30 phút, sau đó ngâm với vi khuan ĐHTI
trong 30 phút
NTS: Ngâm hat với vi khuẩn gây bệnh CXT3 trong 30 phút NT6: Ngâm hạt với nước cất
NT7: Ngâm hat với vi khuẩn ĐXTI trong 30 phút
NTS8: Ngâm hạt với vi khuẩn CC - LD 2.2 trong 30 phút NT9: Ngâm hạt với vi khuân DXT6 trong 30 phút
NT10: Ngâm hạt với vi khuẩn ĐHTI trong 30 phút
Chỉ tiêu theo dõi
Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng và tỷ lệ bệnh trên 10 NT, mỗi nghiệm thức 3 LLL, mỗi LLL là | đĩa petri, mỗi dia petri là 10 cây.
Chiều dài thân (mm) đo từ gốc đến ngọn. Chiều dài rễ (mm): đo từ gốc đến đỉnh rễ của rễ cọc. Khối lượng tươi (mg); cân khối lượng tất cả 10 cây. Khối lượng khô (mg):
cân khối lượng khô của cây sau khi sấy, cho đến khi đạt trọng lượng không đồi.
Ti lệ bệnh(%)= (số cây bệnh x 100)/ tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức
Hiệu quả giảm bệnh được tính theo công thức (Abbott, 1925)
HQGB (%)= [(C-T)/C]*100
Trong đó: C là tỷ lệ ở NT chi lây nhiễm bệnh. T là ty lệ bệnh ở NT (có xử ly vi khuẩn đối kháng và lây nhiễm bệnh dòng R. solanacearum)
2.4.2 Khảo sát khả năng phòng, trừ bệnh đối với bệnh héo xanh của một số phương
pháp xử lí trong nhà lưới
Chuẩn bị
Chuẩn bị giá thé: giá thé bao gồm đất, xơ dừa, phân bò. Được phối trộn theo tỉ lệ
216)
Hạt giống cà chua F1 siêu kháng bệnh PN — 209, co sở hạt giống Phú Nông
Vi khuân R. solanacearum và các vi khuân đôi kháng được nuôi cây trong môi trường LB
Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Silva và ctv (2003) có cải tiến
Hạt cà chua được xử lí tương tự xử lí phòng, trừ bệnh trong phòng thí nghiệm (mục
2.4.1) (đối với thí nghiệm ngâm hạt).
Hạt cà chua ngâm bằng nước cat, ủ trên giấy loc đã khử trùng (đối với thí nghiệm tưới vi khuẩn lên cây sau khi trồng).
Với phương pháp tưới vi khuẩn gây bệnh va vi khuẩn đối kháng lên cây, áp dụng lên cây sau khi lên đều (khoảng 7 — 10 ngày sau khi trồng)
Chuẩn bị dịch vi khuẩn
+ Dịch vi khuẩn đối kháng và địch vi khuẩn héo xanh: Cho vào mỗi đĩa vi khuẩn 10 ml nước cất vô trùng, dùng lam kính cao lấy huyền phù vi khuẩn. Xác định mật độ vi khuân bằng máy đo mật độ rồi đưa về mật số 10” CFU/ml (đối với nghiệm thức tưới vi khuẩn lên cây)
+ Dịch vi khuan héo xanh và dịch vi khuẩn đối kháng: Nhân nuôi vi khuẩn trong môi trường LB long, sau 36 giờ đo vi khuân bang máy do mật độ, điều chỉnh mật số đạt
107 CFU/ml (đối với nghiệm thức ngâm hat).
Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức là 4 chậu và 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm phòng bệnh
NT1: Ngâm hạt với vi khuẩn DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI 30 phút sau đó ngâm với vi khuẩn gây bệnh CXT3 30 phút
NT2: Khi cây có 2 lá thật (7 -10 ngày sau trồng), tưới vi khuẩn DXT1, CC - LD 2.2, DXT6, ĐHTI sau | ngày tưới vi khuẩn gây bệnh CXT3(10 mI/cây).
NT3: Ngâm hạt với khuẩn DXT1, CC - LD 2.2, DXT6, ĐHTI 30 phút sau đó ngâm với vi khuẩn bệnh CXT3 30 phút, kết hợp với tưới vi khuẩn đối kháng DXT1, CC
— LĐ 2.2, DXT6, ĐHTI, sau 1 ngày tưới khuân bệnh CXT3 (10 ml/ cây).
NT4: Ngâm hạt với vi khuẩn gây bệnh CXT3
NT5: Tuoi vi khuẩn gay bệnh CXT3 khi cây có 2 lá thật (7 — 10 ngày sau trồng) NT6: Ngâm hat với vi khuân gây bệnh CXT3 kết hợp với tưới vi khuẩn gây bệnh
CXT3 lên cây.
NT7: Ngâm hạt với vi khuẩn đối kháng ĐXTI, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI 30
phút.
NTS: Tưới vi khuẩn đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI khi cây có 2 lá thật (7 -10 ngày sau trồng).
NT9: Ngâm hạt với vi khuẩn đối kháng ĐXTI, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI 30 phút, kết hợp với tưới vi khuẩn đối kháng lên cây
NT10: Xử lý hạt với nước cất
Thí nghiệm trừ bệnh
NTI: Ngâm hạt với vi khuẩn gây bệnh CXT3 30 phút sau đó ngâm hạt với vi khuẩn đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI 30 phút.
NT2: Khi cây có 2 lá thật (7 -10 ngày sau trồng), tưới vi khuẩn gây bệnh lên cây, sau | ngày tưới vi khuân đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI (10 ml/cây).
NT3: Ngâm hạt với vi khuân bệnh 30 phút sau đó ngâm với vi khuân đối kháng ĐXTI, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI 30 phút, kết hợp với tưới vi khuẩn bệnh CXT3 sau
1 ngày tưới vi khuẩn đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI lên cây NT4: Ngâm hạt với vi khuẩn gây bệnh CXT3 trong 30 phút
NTS: Tưới vi khuẩn gây bệnh CXT3 khi cây có 2 lá thật (7 — 10 ngày sau trồng)
(10 ml/ cây).
NT6: Ngâm hat với vi khuẩn gây bệnh CXT3 trong 30 phút, kết hop với tưới vi khuẩn gây bệnh lên cây khi cây lên đều (10 ml/ cây).
NT7: Ngâm hạt với vi khuẩn đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI trong
30 phút.
NT8: Tưới vi khuẩn đối kháng DXT1, CC - LD 2.2, DXT6, ĐHTI (10 ml/ cây).
NT9: Ngâm hat với vi khuẩn đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI kết hợp với tưới vi khuẩn đối kháng DXT1, CC — LD 2.2, DXT6, ĐHTI lên cây (10 ml/
cây).
NT10: Xử lý hạt với nước cất
Chỉ tiêu theo dõi
Tiến hành lấy chỉ tiêu khi bệnh bắt đầu xuất hiện ở 1 trong các nghiệm thức xử lý vi khuẩn gây bệnh
Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) (Jeger và ctv, 2001)
AUDPC =3=¡[Œi+¡ + Ÿ/)/2] (tisa — ti)
Trong đó: i là lần theo dõi bệnh thứ i; n là tổng số lần theo dõi bệnh; Y là tỷ lệ bệnh (%); t là số ngày đánh giá bệnh
Chỉ số bệnh được tính theo công thức
CSB (%) = (4n + 3n; + 2n2+ n1)/ 4N
Trong đó: N là tổng số cây trong nghiệm thức; na là số cây bị nhiễm bệnh cấp 4; n3 là số cây bị nhiễm bệnh cấp 3; nạ là số cây bị nhiễm bệnh cấp 2; mị là số cây bị nhiễm bệnh cấp 1
Cấp bệnh được đánh giá theo thang đánh giá của Deberdt và ctv (1999) Có 1 lá héo rũ: cấp 1
Có 2 — 3 lá héo rũ: cấp 2 Có 4 lá trở lên héo rũ: cấp 3 Cây chết: cấp 4
Hiệu quả giảm bệnh được tính theo công thức sau (Abbott, 1925) HQGB (%)= [(C-T)/C]*100
Trong đó: C là tỷ lệ ở NT chi lây nhiễm bệnh. T là tỷ lệ bệnh ở NT (có xử lý vi khuẩn đối kháng và lây nhiễm bệnh dòng R. solanacearum)
2.4.3 Đánh giá khả năng phòng, trừ bệnh của một số vi khuẩn đối kháng đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trong điều kiện nhà lưới
Chuẩn bị
Chuẩn bị giá thé: giá thé chuẩn bị gồm: dat, xơ dừa và phân bò được trộn theo tỷ
lệ 2:1:1.
Chuẩn bị hạt: hạt cà chua F1 siêu kháng bệnh PN — 209, cơ sở hạt giống Phú Nông được ủ nảy mầm.
Vi khuan Ralstonia solanacearum, vi khuân đối kháng được nuôi cấy trong môi
trường LB.
Phương pháp thực hiện
Sau khi thí nghiệm ở mục 2.4.2 cho kết quả, lựa chọn nghiệm thức có hiệu quả phòng trừ bệnh cao nhất áp dụng cho thí nghiệm
Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiều hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tô gồm 4 dòng vi khuẩn. Với 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại mỗi LLL là 10 chậu. Trong đó có 4 nghiệm thức với mỗi nghiệm thức là 1 dòng vi khuẩn, 1 nghiệm thức xử lý nước cất, 1 nghiệm thức xử lý vi khuẩn bệnh và 4 nghiệm thức chi xử lý vi khuân đối kháng tương ứng với 4 dòng vi khuẩn.
Thí nghiệm phòng bệnh
NTI: Ngâm hat với vi khuân DXT1 30 phút, sau đó ngâm với vi khuan gây bệnh
CXT3 30 phút
NT2: Ngâm hat với vi khuân CC — LD 2.2 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn gây
bệnh CXT3 30 phút
NT3: Ngâm hạt với vi khuẩn DXT6 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn gây bệnh
CXT3 30 phút
NT4: Ngâm hạt với vi khuẩn ĐHTI 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn gây bệnh
CXT3 30 phút
NT5: Ngâm hạt với vi khuân gây bệnh CXT3 30 phút NT6: Ngâm hạt với nước cất
NT7: Ngâm hạt với vi khuân DXT1 30 phút
NT§: Ngâm hạt với vi khuẩn CC - LD 2.2 30 phút NT9: Ngâm hạt với vi khuân DXT6 30 phút
NT10: Ngâm hạt với DHT1 30 phút
Thí nghiệm trừ bệnh
NTI: Ngâm hạt với vi khuẩn CXT3 trong 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn DXT1
NT2: Ngâm hạt với vi khuân CXT3 30 phút, sau đó ngâm với vi khuẩn CC — LD
2.2 30 phút
NT3: Ngâm hạt với vi khuân CXT3 30 phút, sau đó ngâm với vi khuân DXT6 30
phút
NT4: Ngâm hạt với vi khuân CXT3 30 phút, sau đó ngâm với vi khuân ĐHTI
trong 30 phút
NT5: Ngâm hat với vi khuân gây bệnh CXT3 trong 30 phút NT6: Ngâm hạt với nước cất
NT7: Ngâm hạt với vi khuân DXT1 trong 30 phút
NTS: Ngâm hạt với vi khuan CC - LD 2.2 trong 30 phút NT9: Ngâm hạt với vi khuân ĐXT6 trong 30 phút
NT10: Ngâm hat với vi khuẩn ĐHTI trong 30 phút
Chỉ tiêu theo dõi
Lay chỉ tiêu ở 10 NT, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL là 6 chậu, mỗi chậu lấy chỉ tiêu
5 cây.
Tiến hành lấy chỉ tiêu khi bệnh bắt đầu xuất hiện ở nghiệm thức xử lý vi khuẩn
gây bệnh CXT3.
Tỉ lệ bệnh(%)= (số cây bệnh x 100) / tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức Chi số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) (Jeger và ctv, 2001)
AUDPC =}7=7[Œi„¡ + Ÿj)/2] X (tin — 6)
Trong đó: i là lần theo dõi bệnh thứ i; n là tổng số lần theo đõi bệnh; Y là tỷ lệ bệnh (%); t là số ngày đánh giá bệnh
Chỉ số bệnh được tính theo công thức
CSB (%) = (4n + 3n3 + 2nạ + nị )/ 4N
Trong đó: Trong đó: N là tổng số cây trong nghiệm thức; m4 là số cây bị nhiễm bệnh cấp 4; n3 là số cây bị nhiễm bệnh cap 3; m là số cây bị nhiễm bệnh cấp 2; ni là số cây bị nhiễm bệnh cấp 1
Cấp bệnh được đánh giá theo thang đánh giá của Deberdt và ctv (1999) Có 1 lá héo rũ: cấp 1
Có 2 — 3 lá héo rũ: cấp 2 Có 4 lá trở lên héo rũ: cấp 3 Cây chết: cấp 4
Hiệu quả giảm bệnh được tính theo công thức (Abbott, 1925)
HQGB (%)= [(C-T)/C]*100
Trong đó: C là tỷ lệ ở NT chỉ lây nhiễm bệnh T là ty lệ bệnh ở NT (có xử ly vi khuẩn đối kháng và lây nhiễm bệnh dòng R. solancearum)
2.5 Xử lí số liệu
Các số liệu được tông hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2016.
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng Ducan sử dụng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3