3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: 08/2022 — 12/2022, Phòng Sinh học Phân Tử (A204), Tòa nhà A2, Viện
Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng 1: Các giống khoai mì có trong bộ cơ cấu giống khoai mi ở trên địa ban huyện Tân Châu, tỉnh Tây Ninh. Thu thập mẫu bang cách chọn ra 6 ruộng, mỗi ruộng 1 giống, tông cộng có 6 giống. Mỗi giống thu mẫu gồm có :
e Giống HN97 ( kháng kham) tại xã Thanh Đông, huyện Tân Châu: 5 mẫu lá non
° Giống HN3 (kháng kham) tại xã Thanh Dong, huyện Tân Châu: 5 mẫu lá non
° Giống HNS (kháng kham) tại xã Thạnh Dong, huyện Tân Châu: 5 mẫu lá non
° Giống HNI (kháng khảm) tại Thị tran Tân Châu, huyện Tân Châu: 5 mẫu lá non e Giống KM505 (bị bệnh khảm) tại Thị tran Tân Châu, huyện Tân Châu: 5 mẫu lá
non + 1 mẫu chưa triệu chứng.
e Giống KM140 (bị bệnh khảm) tại xã Thanh Đông, huyện Tân Châu: 5 mẫu lá non + 1 mẫu chưa triệu chứng.
Tổng số 32 mẫu được thu thập.
Đối tượng 2: Các cây khoai mì có biểu hiện, triệu chứng bệnh kham lá, chọn các cây dé thu mẫu va mô tả đặc điểm bệnh khám trên lá non, lá già, thân cây.
3.2.2 Hóa chất và thiết bị
Hóa chất dùng dé ly trích DNA: Dung dịch đệm li trích, dung dich PCI gồm
phenol/chloroform/1soamyl alcohol ( 25:24:1) , chloroform, ethanol 70%, 99%, dung dich dém TE 1X.
Hóa chat dùng trong Multiplex PCR: Master mix, nước khử ion, primer đặc hiệu
cho SLCMV, ACMV, EACMV.
14
Hóa chất dùng trong điện di: Agarose, dung dịch TBE 0.5X, loading buffer, ladder,
Gelred.
Các thiết bị dùng trong thí nghiệm: Chay nghiền mau, eppendorf 0,2 ml, 1,5 ml, pipette, đầu tip, máy ly tâm, may PCR, bộ điện di, máy chụp gel.
3.2.3 Tổ hợp mỗi dùng trong phản ứng Multiplex PCR
Các tổ hợp primer bao gồm té hợp primer CMBRep/F, ACMVRep/R, EACMVRep/R phát hiện các dong virus ACMV (368 bp) và EACMV (650 bp), t6 hop primer SLCMV-F và SLCMV-R phát hiện dòng virus SLCMV (1056 bp). Kết qua cho thay 100% số mau khoai
mì được thu thập ở Tay Ninh có sự hiện diện của 3 dòng virus ACMV (368 bp), EACMV (650 bp) và SLCMV (1056 bp) ( Lê Đức Hưng & ctv, 2019). Do đó, trong thí nghiệm dùng
các tô hợp môi nảy nhằm xác định lại các giống nhiễm bệnh. Trong đó CMBRep/F là
Forward primer cho cả 2 dòng virus ACMV và EACMV.
Bang 3. 1 Trinh tự các cặp primer CMBRep/F, ACMVRep/R phat hiện virus ACMV;
cặp CMBRep/F, EACMVRep/R phat hiện virus EACMV; cặp SLCMV-F, SLCMV-R phat hién SLCMV.
Kích thước
Tên primer Trinh tự 5’- 3’ doan khuéch Nguồn
đại CMBRep/F CATCAATGACGTTGTACCA 368 bp
ACMVRep/R CAGCGGCAGTAAGTCCGA Duraisamy CMBRep/F CATCAATGACGTTGTACCA 650 bp & ctv (2013 ) EACMVRep/R GGTTTGCAGAGAACTACATC
SLCMV-F TAGC TGCCCTGTGTTGGAC 1056 bp Olufemi & ctv SLCMV-R TGAGAAACCCACGATTCAGA (2008)
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát và mô tả triệu chứng các giống bệnh
Mô tả triệu chứng bệnh kham trên lá non, lá già và thân của 2 giống bị bệnh khảm
là KM505 và KM140.
15
3.3.2 Sử dụng phương pháp Multiplex PCR để chuẩn đoán, phát hiện virus gây bệnh kham trên các giống khoai mì.
3.3.2.1 Ly trích DNA theo phương pháp SDS
Các mẫu lá non có triệu chứng bệnh được thu thập dé ly trích DNA theo phương pháp SDS nhằm phục vụ việc chuẩn đoán, phát hiện sự hiện diện của virus gây bệnh.
Thành phan dung dich lysis buffer bao gồm Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,05 M, NaCl
0,01 M, SDS 1%.
Quy trinh ly trich DNA:
Bước 1: cho 50 mg — 100 mg mẫu lá vào eppendorf 1,5 ml
Bước 2: thêm 500 ul lysis buffer vào eppendorf 1,5 ml chứa mau, nghiền mẫu
Bước 3: thêm 500 ul Phenol/Chloroform/Isoamyl (25:24:1), vortex
Bước 4: ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, hút dich nổi (Vì pl) Bước 5: thêm Vị pl chloroform, lắc đều
Bước 6: ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, hút dịch nổi (V› ul)
Bước 7: thêm 2V2 pl ethanol 99% lạnh, dao nhẹ
Bước 8: ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ địch nồi. Thu cặn Bước 9: rửa ethanol 70% lạnh 2 lần, phơi khô mẫu
Bước 10: thêm 50 pl dung dịch TE vào. Bảo quản mẫu ở - 20°C
3.3.2.2 Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện virus gây bệnh
LH Kiểm tra DNA tổng số:
Đề xác định sự hiện diện và chất lượng của DNA, sử dụng phương pháp điện di
DNA trên Gel Agarose 1% trong dung dịch đệm TBE 0.5X, dùng pipette hút 10 wl GelRed
chia thành các giọt nhỏ trên giấy bạc, sau đó hút 5 yl mẫu trộn với những giọt GelRed va bơm vào từng giếng. Sau khi điện di, quan sát Gel đưới đèn UV.
Kết quả quan sát hiện rõ các band sáng, đủ tiêu chuẩn đề thực hiện phản ứng PCR.
Q) Thực hiện phan ứng Multiplex PCR:
16
Thao tác trong tủ cấy vô trùng, bề mặt thí nghiệm được khử trùng sạch sẽ, tránh hiện tượng tạp nhiễm gây sai lệch kết quả. Thực hiện phản ứng với mỗi giống là 10 mẫu có triệu chứng bệnh. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng được thực hiện theo bảng
sau:
Bảng 3. 2 Thành phần phản ứng PCR phát hiện virus SLCMV
Thành Phần Nong độ hóa chất Nồng độphảnứng Thể tích (0l)
Master Mix 2X 1X 6,25 Primer SLCMV-F 10 uM 0,4 uM | Primer SLCMV-R 10 uM 0,4 uM |
DNA mẫu 0,5
HO Xã
Tổng thể tích 135
Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng Multiplex PCR phát hiện virus ACMV, EACMV Thành phần Nong độ hóa chất Nong độ phan ing Thế tích ( pl)
Master Mix 2X 1X 6,25 Primer CMBRep/F 10 uM 0,4 uM 2 Primer ACMVRep/R 10 uM 0,4 uM 1,5 Primer EACMVRep/R 10 uM 0,8 uM 0,5
DNA mau 0,5
H20 1,75
Tổng thé tích 135
Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR va Multiplex PCR phát hiện virus ACMV, EACMV và SLCMV
Giai đoạn Nhiệt độ ( °C) Thời gian (phút) Số chu kì Tiền biến tính 94 2 1 Bién tinh 94 1
Bắt cặp 53 | 35
Kéo đài 72 vụ
17
Hau kéo dài 72 4 1
Kết quả phan ứng được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 2%
trong dung dịch đệm TBE 0.5X, điện di trong 30 phút sau đó quan sát dưới đèn UV.
18