3.1. Thời gian và địa diém thực hiện nghiên cứu
Đề tài được thực hiên từ tháng 9 năm 2022 tại Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường đai học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, khu phố 6, phường Linh Trung, thành phố Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Cây cối xay (thân, lá, hoa, quả) được thu hái vào khoảng tháng 8 năm 2022 tại huyện Sông Cầu, tỉnh Phú Yên. Cây cối xay sau khi thu hái sẽ được rửa sạch, làm khô ở 50°C trong tủ sấy (Memmert, Đức) đến khi độ âm dưới 13% (theo Dược điền Việt Nam V), xay nhỏ thành bột và ray qua ray có đường kính lỗ 1 mm trước khi tiến hành
các thí nghiệm.
3.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Hóa chất: Ethanol 70%, thuốc thử Dragendoff, Clohydric acid, Sat (II) clorua,
Gelatin, Peptone, Yeast Extract, NaCl, Agar, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), Ascorbic acid.
Dụng cu, thiết bi: tủ sấy (Memmert), thiết bị cô quay chân không (Heidoph), máy
xay, các dụng cụ thông dụng trong phòng thí nghiệm.
13
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Khảo sát thành phần hợp chất dược liệu trong dịch chiết cây cối
xay
3.3.1.1. Độ 4m
Nguyên lý của việc xác định độ 4m nguyên liệu được dựa trên sự chênh lệch khối lượng giữa mẫu ban đầu và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (theo TCVN 10788 : 2015). Cân chính xác 2 — 5 g mẫu nguyên liệu vào chén thủy tinh đã biết trước khối lượng, say đến khối lượng không đổi (ở 105°C đến 106°C trong 3 — 4 giờ) trong tủ say (Memmert, Đức). Sau đó, dé nguội chén trong bình hút âm đến nhiệt độ phòng và cân tông khối lượng chén va mẫu, độ âm được tính bằng công thức:
T — (HH — TT
1 = Mam — mo)
m
x 100
Trong do:
mo: Khối lượng chén rỗng (g).
mi: Khối lượng chén va mẫu thử sau khi sấy (8).
m: Khối lượng mẫu thử (g).
H: Độ 4m của mẫu thử (%).
3.3.1.3. Hiệu suất chiết
Hiệu suất chiết là hàm lượng cao chiết thu được so với khối lượng mẫu ban đầu, thực hiện 3 lần lặp lại.
Mẫu được tiến hành chiết ở điều kiện tối ưu ba lần. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc Newstar đường kính 110 mm vào bình cầu cô quay 250 mL (Isolab, Đức) đã biết trước khối lượng, cô quay thu hồi dung môi cho đến cắn, sấy cắn ở 50°C đến khối lượng không đổi, dé nguội trong bình hút âm và ghi nhận khối lượng để xác định hiệu suất chiết. Sau đó, cắn tiếp tục được sấy ở 105°C đến khối lượng không đôi dé xác định độ
âm. Hiệu suat chiét và độ âm cao được tinh theo công thức sau:
p = Lm —TMo) ` 10g
m
h =—— x 100m,—
THỊ — Thọ Trong đó:
mo: Khối lượng bình cau rỗng (g).
my: Khối lượng bình và cắn sau khi say 6 50°C (g).
14
m2: Khối lượng bình và can sau khi say 6 105°C (g).
m: Khối lượng mẫu thử (g).
P: Hiệu suất chiết (%).
h: Độ 4m cao chiết (%)
Kết quả hiệu suất chiết và độ 4m cao được thé hiện dưới dang giá trị trung bình của 5 lần lặp lai (+ SEM).
3.3.1.4. Khảo sát thành phần hợp chất dược liệu trong dịch chiết cây cối xay Mục đích: Xác định các hợp chất có trong dịch chiết cây cối xay.
Phương pháp thực hiện:
Phản ứng định tính các nhóm hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin, saponin
được thực hiện theo phương pháp của Phạm Thanh Ky va ctv (1998).
a) Alkaloid
Cân 2 g bột dược liệu cho vao erlen 100 mL (Schott — Duran, Đức) và kiềm hóa bằng vài giọt NH4OH 25% (Catff1.05432.1000, Merck), và tiến hành chiết alkaloid base
trong dung môi chloroform (Cat#1926601871, Macron) với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
(1:10) bằng phương pháp siêu âm kết hợp ngâm chiết tĩnh trong 24 giờ, chiết lặp lại đến khi bã dược liệu mất mau. Dịch chiết sau đó được lắc nhiều lần với H2SO4 2%
(Cat#7664-93-9, Xilong). Thu lay pha acid bên trên và tiến hành định tính alkaloid với các thuốc thử đặc hiệu.
Thuốc thử Dragendorff (KBil4 — Potassium iodobismuthate): Pha từ hai hỗn hợp thuốc thử Dragendorff A và B. Dung dich A: Hòa tan 0,85 g bismuth (IID) nitrate (Cat#10035-06-0, Xilong) trong 40 mL nước cất và 10 mL acetic acid
(Cat#1.0063.1000, Merck). Dung dịch B: Hoa tan 8 g Potasstum iodide (KI)
(Cat/PO04110500, Scharlau) trong 20 mL nước. Trộn lẫn hai dung dich A và B theo tỉ lệ 1:1 (v/v). Dùng pipette hút chính xác 10 mL hỗn hợp thu được cho vào bình định mức
100 mL (Isolab, Đức), thêm 20 mL acetic acid và định mức đến vạch bang nước cat.
Thêm 3 mL dịch chiết acid đã chuẩn bị vào ống nghiệm và nhỏ từ từ 5 — 10 giọt thuốc thử Dragendorff. Phản ứng dương tính với alkaloid xảy ra khi xuất hiện các kết tủa bông màu cam đỏ (với thuốc thử Dragendorff).
b) Elavonoid
Chiết 5 g dược liệu với 50 mL ethanol 70% (Cat/64-17-5, Chemsol). Dịch chiết được cô quay thu hồi dung môi cho đến cắn, cắn được tiến hành loại các chất tạp nhiễm
15
(chlorophyll, lipid, ...) bang petroleum ether (Cat/6472-49-0, RCI Labscan) sau đó được phân tán trong 50 mL nước cất. Pha nước được lắc phân đoạn với ethyl acetate (EA) (Cat#AC01451000, Scharlau) nhiều lần theo tỉ lệ 1:1 (v/v) nhằm làm giàu các flavonoid, gộp các phân đoạn EA, cô quay thu được cắn, hòa tan cắn với ethanol 70%
dé tiến hành định tính.
Thử nghiệm ferric chloride: lay 2 mL dịch chiết cồn, thêm vào vai giọt dung dịch FeCl; 5% (Cat#7705-08-0, Xilong) và lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay
xanh rêu: có polyphenol. Phan ứng khử hóa (còn được gọi là phản ứng cyanidin, Shinoda
hay Willstater): lay 2 mL dịch chiết cồn, thêm vào một it bột magnesium (Mg)
(Cat#7439-95-4, Xilong) va nhỏ từ từ 5 — 10 giọt HCI đậm đặc (Cat#D1128, Duksan).
Tùy thuộc vào nhóm chất của flavonoid mà phan ứng cho mau từ đỏ tươi, đỏ hồng cho đến đỏ cam, cam hoặc vàng.
c) Saponin
Thêm 5 g dược liệu cùng 50 mL nước cất vào erlen 250 mL (Schott — Duran, Đức) và đun sôi 15 phút hay chiết siêu âm trong 20 phút, lọc lay dich chiết, dé nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành định tính.
Phản ứng tạo bot: lay 5 mL dịch chiết nước cho vào ống nghiệm, dùng ngón tay cái bịt chặt miêng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều doc trong 1 phút (khoảng 20 — 30 lần lắc). Dé yên ống nghiệm và quan sát cột bọt theo thời gian (15, 30, 60 phút) và đánh giá kết quả. Thời gian cột bọt tồn tại càng lâu, phản ứng càng dương tính rõ với saponin.
d) Tanin
Thêm 5 g dược liệu cùng 50 mL nước cat vào erlen 250 mL (Schott — Duran, Đức) và dun sôi 15 phút hay chiết siêu âm trong 20 phút, lọc lay dịch chiết, dé nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành định tính.
Thử nghiệm ferric chloride: lấy 2 mL địch chiết nước, thêm vào vài giọt dung dịch FeCl3 5% (Cat#7705-08-0, Xilong) và lắc đều. Nếu dung địch có màu xanh den hay
xanh rêu: có polyphenol.
Phản ứng với chì acetate trung tính: lấy 2 mL dịch chiết, thêm 2 giọt chì acetate 10% (Cat#6080-56-4, Xilong). Nếu xuất hiện tủa bông: có các o-diphenol với nhiều nhóm hydroxyl (-OH) kề cạnh nhau như galloyl, gallate...
16
Phản ứng với gelatin — muối (phan ứng thuộc da): lay 2 mL dịch chiết, thêm vài giọt dung dich gelatin — muối (1% gelatin (Cat#9000-70-8, Xilong) trong dung dịch NaCl 10% (Cat#7647-14-5, Xilong)). Nếu xuất hiện tủa bông trang: có tannin.
3.3.2. Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết cây cối xay
3.3.2.1. Khảo sát hoạt tính khang vi sinh
Vật liệu: Dịch chiết của cây cối xay.
Đối tượng: Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella spp. Được cung cấp bởi phòng Vi sinh Ribe 311, Viện Công nghệ sinh hoc và Môi trường, Trường
đại học Nông Lâm.
Mục dich: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh của dịch chiết.
Tiến hành trong phòng thí nghiệm với 1 yếu tố 3 nghiệm thức là Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella sp, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Phương pháp thực hiện:
Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch hay phương pháp
Kirby - Bauer.
Quy trình chiết: Cho 5 g dược liệu va 50 mL ethanol 70% (Cat#64-17-5, Chemsol) vào erlen 250 mL (Schott — Duran, Đức), chiết siêu âm trong 20 phút, lọc lấy dịch chiết.
Dịch chiết được cô quay thu hồi dung môi cho đến cắn. Cân và hòa tan với dung môi
nước tỉ lên 1:5.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuan bi dia petri chứa môi trường LB dành cho cay khuẩn, mỗi đĩa 20
mL.
Bước 2: Dùng pipet hút 100 wL dich khuẩn với nồng độ 108 CEU/HL lên mỗi đĩa môi trường đã chuẩn bị. Dùng que cấy trang đều trên bề mặt môi trường đến khi khô.
Sử dụng các đĩa giấy thấm vô trùng đường kính 0,5 cm ngâm trong ống nghiệm chứa 50 uL dich chiết, sau đó đặt lên bề mặt. Đối chứng dương (+) là kháng sinh Tetracyclin 30 mg/mL, Đối chứng âm (-) là nước.
Bước 3: Các đĩa thạch được ủ ấm ở nhiệt độ 35 - 371. Sau 24 - 48 giờ tiến hành đọc kết quả.
Dựa vào đường kính của vùng ức chế chúng ta sẽ xác định được độ nhạy của kháng sinh cũng như độ kháng kháng thuốc của vi khuẩn. Đường kính vùng ức chế ty lệ thuận
với mức độ nhạy cảm.
17
Xác định đường kính vòng kháng vi sinh:
Hoạt tính kháng vi sinh được tính bằng đường kính vòng kháng vi sinh.
AD. AD = D - d (mm) Trong đó:
D: đường kính vòng vô khuan/nam (mm) d: đường kính giấy thâm vô trùng (mm).
3.3.1.2. Khảo sát tính kháng oxy hóa
Vật liệu: Dịch chiết cây cối xay.
Mục dich: Khảo sat tính kháng oxy hóa của dịch chiết.
Thí nghiệm được bé trí ngẫu nhiên với 1 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Quy trình chiết: Cho 5 g được liệu và 50 mL ethanol 70% (Cat#64-17-5, Chemsol) vào erlen 250 mL (Schott — Duran, Đức), chiết siêu âm trong 20 phút, lọc lay dich chiét.
Phương pháp thực hiện:
Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH. Khả năng bắt gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Marsden Blois (1958). Các chất kháng oxi hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) tự do tạo thành sản phẩm khử DPPH-H (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine), dung dich phản ứng sẽ chuyên từ màu tím sang màu vàng, làm giảm độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước
sóng 517 nm.
Ascorbic acid (vitamin C) được sử dung làm đối chứng dương (+), đối chứng âm (-) là đung môi chiết.
Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxi hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phan trăm ức chế (AA%) được tính theo công
thức:
Ac— T
——— x 100
Ac
AA% =
Trong đó: Ac là độ hấp thu của mẫu chứng âm Ar là độ hấp thu của mẫu thử
Từ kết quả xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b với y là hệ số bắt gốc tự do, x là nồng độ mẫu thử và
a, b là hăng sô.
18
Nong độ mau thử có thé bắt được 50% gốc tự do DPPH gọi là ICso. Tinh giá trị ICso của mẫu thử dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính kháng oxi
hóa của chúng, theo công thức sau:
50—b ICs =50 a
Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biéu diễn dưới dang giá trị
trung bình + SD.
19