4.1. Kết quả
4.1.1. Đặc điểm bột cây cối xay
Cây cối xay sau khi thu hái sẽ được rửa sạch, làm khô ở 50°C trong tủ sấy (Memmert, Đức) đến khi độ âm dưới 13% (theo Dược điển Việt Nam V), xay nhỏ thành bột và ray qua ray có đường kính 16 1 mm trước khi tiến hành các thí nghiệm.
Hình 4.1. Đặc điểm cây cối xay sau sấy và xay nhuyễn. a) Cây cối xay sau say; b) Bột cây cối xay sau khi xay nhuyễn; c) Bột cây cối xay sau khi xay ray qua ray có đường
kính 1 mm.
Bột cây cối xay được đưa đi làm thí nghiệm có màu nâu nhạt, mùi thơm nhẹ, kích thước hạt nhỏ hơn hoặc bằng | mm.
4.2.1. Định tính sự hiện diện một số hợp chất có trong cây cối xay 4.2.1.1. Độ ẩm và hiệu suất chiết
Bảng 4.1. Bảng kết quả độ ẩm và hiệu xuất chiết
Chỉ tiêu Don vi Ham luong
Độ âm trung bình '% 11,03 + 0,06 Hiệu suất chiết % 18+0,24 Độ âm cao chiết % 6,37 + 0,78
Kết quả được tính trên mẫu khô kiệt, thê hiện dưới dang giá trị trung bình (+ SEM) của ba lần lặp lại.
Sau khi bột cây cối xay được đem đi xác định độ âm theo TCVN 10788:2015. Kết quả thu được sau 3 lần lặp lại cho thấy, độ âm trung bình của bột cây cối xay là 11,03%
20
đạt ngưỡng an toàn cho quá trình lưu giữ (độ âm an toàn không vượt quá 13% theo Bộ Y tế, 2011).
Dược liệu được tiến hành chiết kiệt ở điều kiện tối ưu. Kết qua của ba lần chiết xuất độc lập cho thấy, hiệu suất chiết trung bình đạt được là 18% với lượng cao thu được có độ 4m là 6,3 % đạt tiêu chuẩn an toàn theo Dược điển Việt Nam V đối với cao thuốc đặc (sự mat khối lượng khi làm khô không vượt quá 20%).
4.1.1.2. Định tính
Thí nghiệm định tính nhằm khang định sự hiện diện của polyphenol và các nhóm hợp chất khác. Kết quả được thê hiện trong Bảng 4.3.
Bảng 4.2. Kết quả định tính một số hợp chất trong bột cây cối xay
Nhóm hợp chất Phản ứng/thuốc thử Kết quả Alkaloid Dragendorff +
Flavonoid Mg, HCl + Polyphenol :
Tannin Gelatin- muôi -
Saponin Lac tao bot +
Chú thích: +: Hiện diện; —: Không có.
Các phản ứng định tính:
Alkaloid: Sau khi bỏ 5 giọt thuốc thử Dragendorff vào 3 mL dịch chiết thấy xuất hiện kết tủa màu cam đỏ, chứng tỏ có alkaloid trong mẫu thử.
Hình 4.2. Phan ứng định tinh Alkaloid. a) Dich chiét ethanol 70%;
b) Dich chiết + FeCl3; e) Dich chiết + thuốc thử Dragendorff.
21
Polyphenol: Lay 2 ml dịch chiết thêm vài giọt dung dịch FeCl; 5% sau phản ứng dung dịch có màu xanh đen, chứng tỏ trong mẫu thử có polyphenol.
Flavonoid: Sau khi lay 2 mL dịch chiết thêm vào một ít bột Mg và nhỏ từ từ 5 — 10 giọt HCl đậm đặc, dung dịch chuyển sang màu đỏ cam, chứng tỏ có flavonoid trong mẫu thử. Dé thêm khẳng định trong dịch chiết có flavonid ta thực hiện thêm phan ứng với Pb, sau phản ứng thấy xuất hiện kết tủa.
Tannin: Sau cho vài giót dung dich gelatin — muối vào 2 mL dich chiết, phản ứng không thấy xuất hiện kết tủa bông trắng, chứng tỏ trong mẫu thử không có tannin.
Hình 4.3. Kết quả đinh tính flavonoid và tanin. a) Dịch chiết ethanol 70%; b) Dich chiết + FeCH; c) Dịch chiết + Pb; d) Dịch chiết + Meg + HCl đậm đặc; e) Dich chiét + gelatin mudi.
Saponin: Sau khi lắc 5 mL dịch chiết trong ống nghiệm trong 1 phút thay xuất hiện bọt bền hơn 30 phút, chứng tỏ có saponin trong mẫu thử.
Hình 4.4. Kết quả định saponin. a) Dịch chiết ethanol 70%; b) Bọt bên hơn 30 phút.
22
Kết quả định tính cho thấy trong cây cối xay có sự hiện điện của Alkaloid,
flavonoid, saponin va không có tannin.
4.1.2. Hoạt tinh sinh học của cây cối cây
4.1.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cây cối xay
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tan đĩa giấy của Kirby — Bauer được thể hiện trong Hình 4.4.
(-) Đối chứng âm: nước cất; (E): Dịch chiết cây cối xay
Sau khoảng thời gian sinh trưởng thích hợp của vi sinh vật (24 giờ đối với E. coli va Salmonella và 72 giờ đỗi với S. aureus), cao chiết cay côi xay ở nghiệm thức đã thé hiện hoạt tính kháng khuẩn thông qua sự hình thành vòng vô khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn gây bệnh là S. aureus và Salmonella. Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết từ điều kiện tối ưu và đối chứng dương tetracyclin được ghi nhận trong Bảng 4.4.
Bang 4.3. Kết quả đường kính vòng vô khuan
, Nong độ Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Chât khảo sát
(mg/mL) E. coli Salmonella S. aureus
Tetracyclin 20 21,33 + 2,73 | 20,33+0,33 | 38,33 + 1,67 Dich chiết cây cối xay 50 = 15+ 1,73 9,33 + 1,76 Chú thích: -: không có vòng vô khuẩn.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây cối xay ở nghiệm thức đã thé hiện hoạt tính kháng đối với hai chủng vi khuẩn gây bệnh là S. aureus và Salmonella, tuy nhiên không thê hiện hoạt tính kháng đối vối E. coli. Vòng vô khuẩn thê hiện rõ và có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Trong đó, khả năng kháng của dịch chiết cây cối xay đối với Salmonella là 15 mm + 1,73 và S. aureus là 9,33 mm + 1,76.
23
4.1.2.2. Hoạt tính kháng oxi hóa của cây cối xay
Dựa trên kết quả đo độ hap thu tại bước sóng 517 nm va tính toán kết quả hoạt tính chống oxy hóa (IC) của ascorbic acid và cao chiết cây cối xay, ta xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính thé hiện mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ chất khảo sát trong phản ứng DPPH có dạng y = ax + b. Trong đó, y là hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ chất khảo sát. Thay giá trị y = 50, từ các hệ số a, b của phương trình hồi quy ta tìm được giá trị ICso tương ứng. Kết quá xác định giá trị ICso
được trình bày trong Bảng 4.5.
Bảng 4.4. Kết quả xác định IC50 theo phương pháp DPPH.
Chất khảo sát Phương trình hồi quy ICso (mg/L)
Ascorbic acid y = 3,6844x - 22,884 R?= 0,9899 19,78
Dich chiét cay cối xay y=0,0028x+ 22,242 R? = 0,9967 10053+ 69,8 Kết quả được thé hiện dưới dang giá trị trung bình (+ SEM) của ba lân lặp lại.
Phương trình biéu điễn mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ của Ascorbic acid có dạng y = 3,6844x - 22,884 và R?= 0,9899. Thay y = 50, giá trị ICso cua Ascorbic acid tìm được là 19,78 mg/L.
120 ơ
` y=3.6844x - 22.884
R?= 0.9899
ceve
S 60 -
©
—
30 -
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Nồng độ (mg/L)
Hình 4.6. Hoạt tinh khang oxy hóa của Ascorbic acid trong thử nghiệm DPPH
Phương trình biéu diễn mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa va nồng độ của dịch chiết cây cối xay có dạng y = 0,0028x + 22,242 và R? = 0,9967. Thay y = 50,
giá tri ICso cua Ascorbic acid tìm được là 10053+ 69,8 mg/L.
24
100.00 ơ
y = 0.0028x + 22.242 80.00 + R? = 0.9967
60.00 +
=iS
ằ 40.00 +
=
20.00 +
0.00 T T T T 1 0 5000 10000 15000 20000 25000
Nong độ (mg/L)
Hình 4.7. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết cây cối xay trong thử nghiệm
4.2. Thảo luận
4.2.1. Định tính sự hiện diện một số chất trong cây cối xay
Độ âm là một yếu tố ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình bảo quản dược liệu. Trong nghiên cứu này, độ âm của mẫu là 11,03% đạt ngưỡng an toàn cho quá trình lưu giữ (độ am an toàn không vượt quá 13% theo Bộ Y tế, 2011). Độ 4m càng thấp càng hạn chế hoạt động của các vi sinh vật phân giải hay nấm men, nắm mốc gây hư hại cũng như hạn chế tác động của các enzyme, khiến chúng không thê xúc tác các phản ứng sinh hóa làm biến đổi thành phần hoạt chất của được liệu.
Từ kết quả được trình bày trong Bảng 4.2, nhìn chung, khối lượng cao thô qua ba lần lặp lại không có sự biến động lớn. Khối lượng cao thu được lần lược là 0,554 g, 0,529 g và 0,539 g tương ứng với hiệu suất chiết là 18,43%, 17,6% và 17,96%. Độ âm của cao sau khi xử lý thô là 6,37% đạt tiêu chuẩn an toàn theo Dược điển Việt Nam V đối với cao thuốc đặc (sự mat khối lượng khi làm khô không vượt quá 20%).
Ở Bảng 4.3 cho thấy rằng cây cối xay tồn tại các hợp chất có giá trị được tính cao như alkaloid, flavonoid, saponin. Kết quả này có sự tương đồng với kết quả nghiên cứu của Ngô Xuân Quang (2012). Đây đều là các hợp chất phổ biến trong thực vật, thể hiện các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, kháng viêm, ức chế enzyme.... Alkaoid có nhiều ứng dụng như chống ký sinh trùng, chống co thắt, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống HIV và hoạt động điệt côn trùng (Joanna,2019). Flavonoid được chứng minh là các hợp chất có tính chống oxy hóa mạnh, bên cạnh đó còn có thêm
25
các hoạt tính khác như kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, ... (Panche và ctv, 2016). Saponin ngoài các hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư thường thấy, còn có nhiều tác động tích cực đến hệ miễn dịch bằng cách can thiệp trực tiếp vào các hoạt động sống của tế bào như ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, vận chuyển nội bao, tính toan vẹn của các bào quan, đóng vai trò như tác nhân oxy hóa khử và truyền tin nội bào, kích hoạt quá trình apoptosis và có vai trò làm 43 bền thành mach thông qua khả năng tán huyết các khối máu đông, tăng cường tuần hoàn máu (Mugford và Osbourn,
2012).
4.2.2. Hoạt tính sinh học của cây cối xay 4.2.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Kết qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ điều kiện tối ưu cho thấy cây côi xay đều thé hiện tinh kháng đối với cả S. aureus và Salmonella. Vòng vô khuẩn thé hiện khá rõ ràng và có thé dé dang nhìn thay bang mắt thường. Kết quả này có phần tương ứng với kết quả định tính kháng khuẩn của Sarkar và ctv (2015) đã được công bố trước đó. Cây cối xay chứa các hợp chất thứ cấp như alkaloid, flavonoid, polyphenol và saponin, các hợp chất này đều được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của các polyphenol diễn ra theo cơ chế bất hoạt các enzyme trong tế bào vi khuẩn, điều này phụ thuộc vao tinh chất cùa các nhóm polyphenol, tốc độ thâm nhập vào tế bào hoặc những ảnh hưởng của chúng đến tính thắm của mang tế bảo vi khuẩn
(Pandey và ctv, 2015).
Flavonoid thê hiện hoạt tính kháng khuẩn thông qua cơ chế ức chế tổng hợp nucleic acid (ức chế enzyme topoisomerase), làm thay đổi chức năng màng và thành tế bao vi khuan bang cách ức chế các tác nhân tổng hợp nên lớp phospholipid của màng và thành peptidoglycan, kìm hãm các chu trình chuyên hóa năng lượng thông qua việc thay đổi tính thấm của màng và ngăn chặn sự hình thành biofilm (Farhadi va ctv, 2019).
Hoạt tính kháng khuẩn của saponin chủ yếu liên quan đến cấu trúc của gốc sapogenin, chiều dài chuỗi và thành phần gốc đường (Patra, 2012). Saponin đóng vai trò như một chat tay phân tử và có thé tăng cường tính thấm của mảng tế bao vi khuẩn, góp phần hỗ trợ các chất kháng khuan xâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn (Jacob và ctv, 1991).
Nhiều nghiên cứu trước đây đã chứng minh khả năng kháng khuẩn của saponin thông qua các tác động liên quan đến tính thấm và gây độc tế bao (Zaynab và ctv, 2021;
Arabski và ctv, 2012).
26
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này dịch chiết không kháng F. coli và đường kính kháng khuẩn cũng thấp hơn so với nghiên cứu trước đó (Sarkar và ctv, 2015), điều này có thê được lý giải như sau. Đầu tiên là dung môi dé hòa tan cao chiết trong thí nghiệm kháng khuẩn, trong nghiên cứu này tác giả sử dụng nước cất dé pha loãng cao chiết.
Nước là dung môi phân cực nên có kha năng các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn có tính chất không phân cực không được hòa tan vào nước (như các flavonoid dạng aglycone...) dan đến kết quả làm giảm hoạt tính kháng khuẩn. Hai là thời điểm thu hoạch chưa thích hợp, theo Dược điển Việt Nam cây cối xay dé có giá trị dược tính tốt nhất khi thu hái vào mùa hạ (tháng 4-6) cũng là thời điểm cây kết quả. Tuy nhiên, cây côi xay duoc sử dung trong nghiên cứu này được thu hoạch vào tháng 8 có thể trong thời điểm này hàm lượng được tính lúc này không cao.
Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cây trên cùng một tác nhân thì thấy hoát tính kháng khuẩn Salmonella của dịch chiết cây cối xay cao hơi lá cây khôi nhung (Huỳnh Văn Biết và ctv, 2020), lá vối (Ngô Thái Bích Vân, 2021), cúc tần (Phùng Thị Hằng, 2022),.... Hoạt tinh kháng khuẩn S. aureus của dịch chiết cây cối xay cao hơn cây màn màn tím (Dịch Thị Phương Anh, 2021),... Khả năng khá khuẩn tùy thuộc vào từng loại cây, từng bộ phận của cây. Ngoài ra chúng còn phụ thuộc vào điều kiện địa lí vùng trồng cây và thời điểm thu hái.
Tác dụng chống vi khuẩn của dịch chiết xuất là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, saponin và một số hợp chất khác có trong dịch chiết. Tuy nhiên, cần phân tích thêm dé tách các hợp chat nay va tìm ra hợp chất hoạt động mạnh nhất có tác dụng kháng khuẩn cũng như làm rõ cơ chế ức chế sự phát triển vi sinh vật thực sự của hợp chất đó.
Kết quả kháng khuẩn cũng rất khả quan khi sử dụng cây cối xay để sản xuất các sản phẩm có khả năng kháng khuẩn, góp phần hạn chế và kiểm soát tình trạng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn hiện nay.
4.2.2.2. Hoat tính kháng oxy hóa
Từ bang 4.5, ta có thé thay được giá trị ICso cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây cối xay thấp hơn ascorbic acid. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết như vậy là tương đối yếu. Ascorbic acid từ lâu đã được biết đến như một chất chống oxy
hóa mạnh và ascorbic acid sử dung trong nghiên cứu nảy là L(+) ascorbic acid (Scharlau,
Tây Ban Nha) thuộc dang tinh khiết (độ tinh khiết trên 99,7%). Trong khi đó, dich cây
27
côi là dạng chiết thô, có thé lẫn tạp các chất không có hoạt tính ngoài các hợp chat có hoạt tính chống oxy hóa như các carbohydrate dạng hòa tan, các acid hữu cơ... Vì vậy, nếu dé xác đinh chính xác nhất khả năng khang oxy hóa của dịch chiết ta cần một quy trình tinh chế sau chiết.
Kết quả trong nghiên cứu này cũng thấp hơn 2 lần so với các nghiên cứu trước (Srividya vad ctv, 2012). Khi so sánh với một số cây dược liệu khác như thân rễ cây thiền liền (Kaempferia galanga L.) với ICso = 2404 mg/L (Trần Thanh Mén, 2020), lá
cây nhàu (Morinda citrifolia L.) với ICso = 917,20 mg/L (Bai Thị Xuân Trang, 2012),
rễ cây quyên bá trường sinh (Selaginella tamariscina) với ICso = 1590 mg/L (Đỗ Bao Ngọc Trân và ctv, 2018),...thi hoạt tính kháng oxy hóa thấp hơn rất nhiều. Tuy nhiên khi so với hạt đu đủ với ICso = 19700 mg/L (Nguyễn Thị Huỳnh Nhu va ctv, 2020), bắp cải tim với ICso = 25786 mg/L (Phạm Ngọc Khôi, 2016),... thì dich chiết cây cối xay cao hơn khoảng 2 lần.
Hoạt tính kháng oxy hóa của cây cối xay và các hợp chất flavonoid và polyphenol có liên quan mật thiết với nhau. Các phân tử polyphenol va flavonoid đóng vai trò don dẹp các gốc tự do (ROS, RNS, peroxide...) hình thành từ các phản ứng sinh hóa trong cơ thé hay từ các yếu tô ngoại sinh (stress, nhiễm trùng, ...) nhờ các nhóm gốc hydroxyl trong cấu trúc hóa học của chúng. Các nhóm hydroxyl có khả năng khử các gốc tự do gây hại một cach dé dàng bằng việc chuyển một nguyên tử hydro qua các gốc tự do này dé trung hoa (Pourmorad va ctv, 2006; Aryal, 2019).
Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của cây cối xay mang lại tiềm năng về một nguồn nguyên liệu mới trong sản xuất dược liệu. Bới vì, kháng oxy hóa là các phân tử có tác dụng chống lại gốc tự do. Điều này giúp cân bằng môi trường tế bào, làm hạn chế
nguy cơ xảy ra các van dé sức khỏe, trong đó có bệnh tiêu đường, tim mạch, ung thư,...
28