DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022.
Địa điểm tiến hành thí nghiệm:
— Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, khoa Khoa học Sinh
học, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh
— Công ty TNHH Phân tích Kiểm nghiệm Việt Tín (39a Đường số 4, An Lạc A, Bình Tân, Thanh phố Hồ Chí Minh).
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hình 3.1. Mẫu Bạc hà.
(a) Bạc hà tươi; (b) Lá bạc hà khô; (c) Bột Bạc ha.
13
Cây Bac hà A (Mentha arvensis L.) và Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L.) được trồng tại Trại thực nghiệm Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh, được thu mua vào giai đoạn cây ra hoa 70 — 80%.
Bạc hà và Hương nhu tươi sau khi thu hoạch được loại bỏ lá úa vàng và lá sâu
sau đó đem đi rửa sạch và phơi khô trong phòng. Phần lá Bạc hà và Hương nhu được
sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu được bảo quản khô trong túi kín và được
hút chân không với độ âm nguyên liệu dưới 13%.
3.2.2. Trang thiết bị và hóa chất Thiết bị
Bộ chưng cất hơi nước (Việt Nam), máy cô quay chân không Buchi Rotavarpor R— 200 - Buchi (Thụy Si), may sắc ký khí ISQTM Series Thermo (ISQ QD GC-MS)
— Thermo Scientific (Mỹ), Cân phân tích, Tủ say (Nhật Bản), máy đo UV — VIS SPECTRO UV — 2510T, Bếp điện (Hàn Quốc), Máy xay mini (Nhật Bản).
Hóa chất ;
Acetic anhydride (Tay Ban Nha), Aceton (Mỹ), Acetic acid (Trung Quốc),
AICI; (Trung Quốc), Bismuth nitrate (Trung Quốc), CH3COOK (Trung Quốc), Chloroform (Việt Nam), CuSOx.5H2O (Trung Quốc), DMSO (Hàm Quốc), DPPH (Anh), Glucose (Trung Quốc), Dietyl ether (Việt Nam), Ethanol (Việt Nam), FeCl (Việt Nam), Folin — ciocalteu (Mỹ), Gallic acid (Trung Quốc), Gelatin (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), HzSO¿ (Trung Quốc), Iod (Malaysia), KI (Trung Quốc),, Kali natri tartrat (Trung Quốc), Methanol (Trung Quốc), Menthol (An Ðộ), NazSO¿
(Trung Quéc), NaOH (Trung Quéc), NaCl (Trung Quéc), Quercetin (Anh), Vanillin
(Viét Nam).
3.2.3. Khảo sát thành phan hóa thực vật của Bạc hà và Hương nhu 3.2.3.1. Độ âm
Độ âm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp cân khối lượng dựa trên sự chênh lệch khối lượng giữa mẫu nguyên liệu ban đầu và mẫu nguyên liệu sau khi say đến khối lượng không đồi.
Cõn chớnh xỏc 2 g mẫu nguyờn liệu, chớnh xỏc đến 0,001 ứ vào chộn sứ đó sõy khô và biết trước khối lượng. Cho chén chứa mẫu nguyên liệu (đã mở nắp) vào tủ say, say ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ. Để nguội chén trong bình hút âm ở nhiệt độ
14
phòng. Đậy nắp và cân. Làm lại các thao tác sấy, để nguội trong bình hút ẩm và cân đến khi khối lượng giữa hai lần cân không đổi (Dược Điền Việt Nam V - Tập 2,
2017).
mi — m2
H= — x 100
mì —mo
Trong đó:
H: độ 4m của mẫu (%).
mo: khối lượng chén sứ và nắp đã được sấy (g).
m¡: khối lượng chén sứ và nắp cùng với mẫu trước khi sấy (g).
ma: khối lượng chén sứ và nắp cùng với mẫu sau khi say (g).
3.2.3.2. Định tính sự hiện diện một số hợp chất có trong Bạc hà và Hương nhu Chuẩn bị mẫu dịch chiết: lá Bạc hà và lá Hương nhu khô được xay thành bột mịn. Dịch chiết Ethanol được chuẩn bị bằng cách cân 5 g bột mỗi loại dược liệu cho vào hai bình thủy tinh sạch và khô, sau đó thêm vào 100 ml Ethanol 70 % vào mỗi bình, đậy kín miệng bình. Dé bình ở nhiệt độ phòng. Lọc thu dịch chiết sau 48 giờ.
Phan ứng định tính các nhóm hợp chất như Flavonoid, Terpenoid, Steroid được thực hiện dựa theo phương pháp của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), định tính Saponin, Alkaloid, Tanin, Đường khử dựa theo phương pháp của Trần Hùng và ctv
(2004).
Định tính Terpenoid
Lay 2 ml dịch chiết, thêm vào 1 ml Chloroform, thêm từ từ 3 giọt H›SOx đậm đặc, nếu có Terpenoid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ.
Định tính Flavonoid
Lay 3 ml dịch chiết cho phản ứng với 1 ml dung dịch NaOH 10%. Sau phản ứng, tùy thuộc vào nhóm chất của Flavonoid mà dung dịch sẽ có màu vàng đến cam, cam đỏ, đỏ đến đỏ tím.
Định tính Steroid
Lấy 5 ml dịch chiết cô cách thủy cho đến can. Hòa can với 2 ml Acetic anhydride, sau đó thêm 2 ml Chlorofrom vào, tiếp theo cho từ từ 3 — 5 giọt H›SOu
15
đậm đặc (phản ứng Salkowski). Phản ứng dương tinh là dung dich đổi thành màu xanh dương, xanh lá, cam hoặc đỏ, màu bền không đôi.
Dinh tính Saponin
Lay 5 ml dịch chiết cô cách thủy cho đến cắn, hòa cắn trong 5 ml ethanol 25 % trên bếp cách thủy sau đó lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước và lắc mạnh theo chiều đọc ống nghiệm. Nếu có cột bọt bền trong 15 phút là dương tính.
Định tính Alkaloid
Thuốc thử Dragendorff: gồm có dung dịch A và B. Dung dich A: hòa tan 0,85 g Bismuth nitrate trong 40 ml nước cất và 10 ml Acetic acid. Dung dịch B: hòa tan 8 g KI trong 20 ml nước cất. Tron dung dich A và dung dich B lại với nhau theo tỉ lệ 1:1.
Cứ 10 ml hỗn hop thu được, thêm vào 20 ml Acetic acid va định mức lên 100 ml bằng nước cat.
Thuốc thử Wagner: hòa tan 2 g Iod và 4 g KI trong 10 ml nước cất trong bình định mức 100 ml. Lắc đều đến khi hỗn hợp tan hoàn toàn và định mức đến vạch bằng nước cất.
Lay 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới can. Hòa cắn trong 4 ml dung dịch HCI 5%. Dùng thuốc thử Dragendorff và thuốc thử Wagner để định tính
Alkaloid.
So sánh kết qua với ống chứng không có thuốc thử, phản ứng dương tinh với Alkaloid đối với thuốc thử Dragendorff cho kết tủa màu cam đỏ, đối với thuốc thử Wagner cho kết tủa màu nâu.
Định tính Polyphenol
Lay 2 ml dịch chiết cô cách thủy cho đến cắn. Hòa cắn với 4 ml nước trên bếp cách thủy. Lọc dịch chiết và cho vào ống nghiệm. Thêm 2 giọt thuốc thử FeCl; 5%
lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có Polyphenol.
Định tính Tannin
Lay 2 ml dịch chiết cô cách thủy cho đến cắn. Hòa cắn với 4 ml nước trên bếp cách thủy. Lọc dịch chiết và cho vào ống nghiệm. Thêm vao dịch lọc 5 giọt dung dịch Gelatin muối, lắc đều. Nếu có tủa bông trắng: có Tannin.
Định tính đường khử
16
Thuốc thử Fehling: được tạo thành từ dung dịch Fehling A và Fehling B.
Fehling A: hòa tan 1 g CuSO¿.5H2O trong 25 ml nước cất. Fehling B: hòa tan 0,5 g Kali natri tartrat và 3,75 g NaOH trong 25 ml nước cất. Trộn dung dịch Fehling A va Fehling B theo ty lệ 1:1 (v/v) ta được thuốc thử Fehling.
Lay 5 ml dịch chiết cô cách thủy cho đến can. Hòa can với 3 ml nước cat trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dich loc 1 ml thuốc thử Fehling, đun cách thủy trong 5 phút. Nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch cho thấy có
sự hiện diện của đường khử, do đường khử với nhóm chức Aldehyde hay Cetone có
trong cấu trúc sẽ khử Cu?” thành CuO (tủa màu đỏ gạch). Thí nghiệm sử dụng Glucose làm đối chứng dương dé so sánh với mẫu dịch chiết.
3.2.3.3. Khảo sát hàm lượng tỉnh dầu và thành phần hóa học của tỉnh dầu
Xác định hàm lượng tinh dầu Bạc hà và tinh dầu Hương nhu bằng phương pháp chưng cắt lôi cuốn hơi nước
Nguyên ly: Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dựa trên sự thâm thấu, hoàn tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao (Lê Ngọc Thạch,
2003).
Tiến hành chiết xuất tinh dầu Bạc ha và tinh dầu Hương nhu bang phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước với 3 lần lặp lại trên mỗi loại được liệu.
Cân trọng lượng mau lá khô của nguyên liệu (250 g). Cho nguyên liệu vào nồi chưng cất và cho nước cất vào ngập nguyên liệu. Đặt nồi trên bếp điện đun sôi liên tục ở nhiệt độ từ 80 — 100°C, tiến hành chưng cất trong 4 giờ. Sau 4 giờ, tắt bếp, dé hệ thống nguội dần trong 15 phút. Thu hỗn hợp tinh dầu và nước vào bình chiết, tráng ống sinh han và ống hứng tinh dau bằng Dietyl ether rồi cho vào bình chiết. Lắc đều bình để tinh dầu tan trong Dietyl ether. Để yên bình trong 10 phút dé tách lớp, lớp trên là tinh dầu tan trong Dietyl ether, lớp dưới là nước. Lớp dưới được tách bỏ, còn lớp trên lọc qua NazSOx khan dé loại nước dư trong hỗn hợp. Cô quay loại dung môi ở 20°C dưới áp suất thấp dé thu nhận tinh dau.
Tinh dầu sau khi cân để xác định hàm lượng được cho vào lọ tối màu, đậy kín
và bảo quản trong tủ lạnh.
Hàm lượng tinh dầu được xác định theo công thức :
17
Khối lượng tỉnh dầu
Hàm lượng tỉnh dầu (%) = = = *100
Khôi lượng mau khô
Phân tích thành phần tinh dầu Bạc hà và tỉnh dầu Hương nhu bằng GC/MS Nguyên lý: vì các thành phan của tinh dầu có thành phần nguyên tố khác nhau, có cau tạo phân tử khác nhau nên khi khí mang (Heli hay Nito) mang tinh dầu qua cột sắc ký mao quản, các thành phần của tỉnh dầu sẽ bị hấp phụ và giải hấp khác nhau trên cột sắc ký, kết quả là thời gian lưu của chúng trên cột khác nhau, detector ghi lại thời gian lưu đó thành các phần trên sắc ký đồ, do đó ứng với mỗi thành phần của tỉnh dầu sẽ có một thời gian lưu và một peak xác định trên sắc ký đồ. Sắc ký đồ có bao nhiêu peak là tinh dầu có bấy nhiêu thành phần (Văn Ngọc Hướng, 2013).
Thành phần tinh dầu Bạc hà và tinh dầu Hương nhu được phân tích trên hệ thống sắc ký khí khối phổ ISQTM Series Thermo (ISQ QD GC-MS) — Thermo Scientific (Mỹ) với bộ lay mẫu tự động AI/AS 1610.
Pha mẫu: các mẫu tinh dầu được pha loãng 100 lần với Aceton trước khi đưa vào hệ thống phân tích sắc ký khí.
Điều kiện phân tích trên sắc ký khí:
Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu 40°C, giữ trong | phút, sau đó tăng 10°C/ phút cho đến 80°C, giữ trong 1 phút, tiếp tục tăng 4°C/ phút cho đến 300°C và giữ trong 5 phút. Thời gian tổng cộng là 66 phút.
Khí mang He: 1,5 ml/ phút.
Thể tích tiêm mẫu: 1 wl.
Chế độ tiêm mẫu chia dòng 1:20.
Nguồn ion hóa EI: máy dò và nhiệt độ ion hóa lần lượt là 250°C và 200°C, chế độ quét fullscan, khối quét 50 — 500 amu.
Xác định thời gian lưu của các chất trên sắc ký đồ giống với thời gian lưu của những chất đã biết khi so sánh các dữ liệu phô MS của chúng với dữ liệu phố chuẩn
trong thư viện phô, từ đó định danh được các cấu tử có trong tinh dầu. Đồng thời, dựa trên diện tích peak của các chất, xác định được tỷ lệ phần trăm các chất có trong mẫu
phân tích.
18
3.2.4. Nghiên cứu tạo hỗn hợp phối vị Bạc hà kết hợp với Hương nhu 3.2.4.1. Xây dựng quy trình bào chế hỗn hợp phối vị
Lá Bạc hà và lá Hương nhu khô được sử dụng để bào chế hỗn hợp phối vị.
Tiến hành sao lá Bạc hà và lá Hương nhu ở nhiệt độ khoảng 40°C — 50°C/ 3 - 4 phút.
Tiếp theo xay nhỏ nguyên liệu với đường kính từ 2 — 3 mm, sau đó cân nguyên liệu và phối trộn theo tỉ lệ (Bảng 3.1.). Dem sấy hỗn hợp phối vị 6 60°C trong 5 phút.
Cuối cùng, cân chính xác 2 g hỗn hợp phối vị vào túi lọc, ép kín miệng túi, bao quản
các túi lọc trong túi zip có hút chân không.
Quá trình bào chế được thực hiện với điều kiện phòng đã lau dọn sạch, kín, hạn chế ra vào. Các dụng cụ và túi đựng duoc say 6 105°C trong 15 phút trước khi sử
dụng.
3.2.4.2. Xác định tỉ lệ phối trộn và thời gian pha trà phù hợp
Phối trộn lá Bạc hà và lá Hương nhu theo các nghiệm thức tỉ lệ: A (10:0), B (9:1); C (7:3), D (5:5), E (3:7), F (0:10). Tiến hành đánh giá cảm quan qua hai giai đoạn dé chọn ra tỉ lệ phối trộn và thời gian pha trà phù hợp. Quá trình đánh giá đảm bảo mẫu không nhiễm vi sinh, độ âm trong ngưỡng cho phép, không ảnh hưởng đến
người sử dụng.
Bảng 3. 1. Tỉ lệ phối trộn Bạc hà và Hương nhu
Nghiệm thức A B C D E F Bac ha 10 9 7 =) 3 0 Tỉ lệ nguyên liệu
Hương nhu 0 | 3 5 7 10 Đánh giá cảm quan
Giai đoạn 1: Đối với mỗi nghiệm thức, pha với 100 ml nước nóng (95 - 100°C), ngâm mẫu trong 5 phút, có màng bọc thực phẩm bịt kín miệng ly. Mẫu đánh giá ở giai đoạn này sẽ dựa trên mức độ yêu thích của người dùng đối với từng nghiệm thức tỉ lệ, thông qua phương pháp cho điểm thị hiếu (hương vị coi là quan trọng nhất) sẽ chọn ra tra có tỉ lệ thành phần phù hop.
Giai đoạn 2: Sau khi chon được tỉ lệ phối trộn phù hợp nhất, tiễn hành pha mẫu với 100 ml nước nóng (95 - 100°C), ngâm mẫu với các khoảng thời gian khác nhau: 5 phút, 10 phút và 20 phút, có màng bọc thực phẩm bit kín miệng ly. Sử dụng
19
mau đánh giá cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 3218 — 2012 dé chọn ra thời gian pha phù hợp cho trà. Thí nghiệm đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm được
thực hiện dựa theo các chỉ tiêu được quy định trong TCVN 3218 — 2012. Cách tính
điểm phải đúng theo quy định đối với từng chỉ tiêu.
3.2.4.3. Khảo sát hàm lượng Flavonoid, Terpenoid, Polyphenol trong hỗn hợp phối vị
Định lượng Terpenoid
Nguyên lý: phương pháp này được gọi là thử nghiệm Vamillin — Acid sulfuric
vì nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là phản ứng của Saponin triterpene oxy
hóa Acid sulfuric với Vanillin, tạo ra màu đỏ tím đặc biệt được đo ở bước sóng từ
473 đến 560 nm (Le và ctv, 2018).
Chất chuân Menthol được chuẩn bị ở các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 (ug/m]) trong ethanol 96 %. Hút 0,25 ml chất chuẩn hay mẫu cần định lượng vào ống
nghiệm. Thêm 0,25 ml Vamillin 8% pha trong ethanol 96 %, thêm 2,5 ml H2SO4 72%
pha trong nước cất. Lắc cách thủy các ống nghiệm đã cho phản ứng trên bếp trong 15 phút ở 60°C. Sau khi làm mát các ống nghiệm trong 5 phút bằng nước lạnh, tiến hành đo độ hấp phụ ở bước sóng 560 nm.
Định lượng Polyphenol
Nguyên lý: phan ứng oxy hóa — khử giữa các hợp chất Polyphenol với thuốc thử Folin - Ciocalteau tạo phức hợp màu xanh lam có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 760 nm (Singleton và ctv, 1999). Phản ứng tạo phức màu xanh được cau thành
bởi phức hợp phosphotungstic - phosphomolybdic acid khi nhận một electron từ các
hợp chất Polyphenol.
Quy trình xác định hàm lượng dựa theo Wani và ctv (2018). Chất chuẩn Gallic acid được chuẩn bị ở các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60 (ug/ml) trong nước cất. Hút 0,5 ml mẫu cần định lượng vào ống nghiệm. Thêm 2,5 ml Folin — Ciocalteu 10 % và 2 ml Na2CO3 7,5%. U mẫu trong tối ở nhiệt độ phòng trong 45 phút. Quy trình tương tự với chất chuẩn Gallic acid. Độ hấp phụ được đo ở bước sóng 760 nm.
Định lượng Flavonoid
Nguyên lý: Hàm lượng Flavonoid được xác định thông qua phản ứng tạo màu
với AICI. AICI; liên kết tạo phức hợp có màu bền với nhóm ketone ở C4 và các
20
nhóm hydroxyl ở C3 hoặc C5 trong cấu trúc của Flavone hay Flavonol. Để định lượng Flavonoid, độ hấp thụ của phức hợp màu được ghi nhận tại bước sóng 415 nm
với phản ứng CH3COOK — AICI3 (Chang va ctv, 2002).
Chất chuẩn Quercetin được chuẩn bị ở các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 ug/ml trong ethanol 80 %. Cho 0,5 ml mẫu cần định lượng vào ống nghiệm. thêm 1,5 ml Ethanol 95 %, 0,1 ml AICI; 10% được pha trong nước cat, 0,1 ml CH3COOK 1M được pha trong nước cat, sau cùng thêm 2,8 ml nước cất vào ống nghiệm. U mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Quy trình tương tự với chất chuan Quercetin. Tiến hành đo độ hấp phụ ở bước sóng 415 nm.
3.2.4.4. Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884: 2005.
Xác định Coliforms theo TCVN 6848: 2007.
Xác định nắm men, nắm mốc theo TCVN 8275 -1:2010.
Xác định Salmonella theo TCVN 4829:2005.
3.2.5. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trong hỗn hợp phối vị 3.3.3.1. Nguyên tắc
Hoạt tính chống oxy hóa được khảo sát thông qua phản ứng giữa các chất chống oxy hóa với DPPH góc bền (Blois, 1958). Dựa trên cơ sở phản ứng trung hòa gốc tự do và làm giảm màu giữa các chất có tác dụng chống oxy hóa với thuốc thử 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Các gốc DPPH tự do có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm và có mau tím. Quá trình thay đối từ màu tim sang màu vàng của DPPH khi có mặt chất chống oxy hóa là do electron tự do của gốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và một nguyên tử hydro đề tạo thành DPPH-H khử. Kết quả của sự khử màu tương đương với lượng nguyên tử hydro được giữ lại
trong DPPH-H.
3.3.2.2. Quy trình
Thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxy hóa được thực hiện dựa theo phương pháp của Bhuiyan và ctv (2009) có hiệu chỉnh. Mẫu nước pha hỗn hợp phối vị với ti lệ, thời gian và thé tích pha mẫu đã xác định được thông qua nghiên cứu ở trên được loại bỏ nước dé thu lay cao bằng cách cô trên bếp cách thủy và sấy ở 50°C. Sau đó, pha loãng mẫu cao với DMSO 50 % thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 ug/ml.
21