DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 4. KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát thành phần hóa thực vật của Bạc hà và Hương nhu
4.1.1. Định tính sự hiện diện một số hợp chất có trong Bạc hà và Hương nhu Thí nghiệm định tính được thực hiện nhằm đánh giá sự hiện diện của một số hợp chất có trong lá Bạc hà và lá Hương nhu. Kết quả định tính các nhóm hợp chất được diễn giải trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả định tính một số hợp chất có trong lá Bạc hà và lá Hương nhu
„ : Kết quả
Nhóm hợp chât Thuôc thử/ Phản ứng
Bạc hà Hương nhu Terpenoid Chloroform + H2SO4 + + Flavonoid NaOH 10% sk +
Steroid Salkowski + + Wagner — — Alkaloid
Dragendoff - =
Saponin Lac tao bot — nh
Polyphenol FeC] 5% + +
Tannin Gelatin muối — —
Đường khử Fehling + + (+): Có mặt nhóm chất; (—): Không có mặt nhóm chất,
Kết quả sơ bộ cho thấy, trong lá Bạc hà và lá Hương nhu đều có sự hiện diện của các hợp chất Terpenoid, Flavonoid, Steroid, Polyphenol và đường khử, không có hợp chat Alkaloid và nghi ngờ sự hiện diện của nhóm chat Tannin. Riêng nhóm chat Saponin chỉ thấy ở lá Hương nhu.
Kết quả định tính đối với dịch chiết Ethanol 70% của lá Bạc hà phù hợp với kết quả nghiên cứu sử dụng dịch chiết Methanol của Patel và ctv (2021), tuy nhiên điểm khác biệt so với nghiên cứu đi trước là không thấy rõ sự hiện diện của Tanin. Còn đối
với dịch chiết lá Hương nhu khi so với kêt quả nghiên cứu của Airaodion va ctv
23
(2019) cũng cho kết quả tương đồng nhưng lại không thấy sự hiện diện của Steroid.
Những sự khác biệt này có thể do dung môi chiết xuất khác nhau hoặc do yếu tố địa lý và thời tiết ảnh hưởng đến sự tổng hợp các nhóm hợp chất trong có cây.
Dựa vào kết quả định tính cho thấy sự hiện diện của Terpenoid, Polyphenol và Flavonoid, đây sẽ là cơ sở đề tiến hành các thí nghiệm định lượng tiếp theo.
Kết quả của các thí nghiệm định tinh đựợc thể hiện từ Hình 4.1 đến 4.8.
= a =
Hinh 4.3. Steroid. (a) DC bac hà; (b) DC hương nhu; (c) DC bac ha + Salkowski; (d) DC hương nhu + Salkowski.
. tee
Hinh 4.4. Alkaloid. (a) DC bac ha; (b) DC hương nhu; (c) DC bạc hà + Wagner; (d) DC huong nhu + Wagner; (e) DC bac ha + Dragendorff, (f) DC hương nhu + Dragendorff
24
Hinh 4.6. Tannin. (a) DC bac hà; (b) DC hương nhu; (c) DC
bạc hà + Gelatin muối; (d) DC hương nhu + Gelatin muối
a b c d e
Hinh 4.7. Saponin. (a) Hình 4.8. Đường khử. (a) Glucose 1%
DC bạc ha không có bot + Fehling; (b) DC bạc hà; (c) DC bên; (b) DC hương nhu hương nhu; (d) DC bạc hà + Fehling;
có bọt bên hơn 15 phúi. (e) DC hương nhu + Fehling.
4.1.2. Xác định hàm lượng tinh dầu Bạc hà và tinh dầu Hương nhu
Thí nghiệm được thực hiện nhằm khảo sát hàm lượng tỉnh dầu có trong lá Bạc hà và lá Hương nhu. Tinh dầu Bạc hà và Hương nhu sau khi chưng cất, loại bỏ nước dư và cô quay đuổi dung môi được tiến hành cân trọng lượng dé xác định hàm lượng tinh dau. Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần độc lập.
Bang 4.2. Hàm lượng tinh dầu
Mẫu Hàm lượng (%)
Bạc hà 2,917+0,1
Huong nhu 1,36° + 0,06
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau co sự khác biệt về
mặt thông kê (P<0,05).
Kết quả định lượng cho thấy, hàm lượng tinh dau trong lá Bạc hà cao hon lá Hương nhu 2,13 lần. Một vài nghiên cứu xác định hàm lượng tinh dầu Bạc hà cho thấy, Bạc hà có hàm lượng tinh dau là 2,73% theo Dinh Hải An (2008), 2,77% theo Nguyễn Trung Tính và Nguyễn Phương Vỹ (2008), Hương nhu có hàm lượng tinh dầu 0,96% theo Nguyễn Phương Hạnh và ctv (2022). Như vậy, kết quả nghiên cứu
được là phù hợp và có ý nghĩa.
4.1.3. Thành phần các chất trong tỉnh dầu bạc hà và tỉnh dầu hương nhu
Tinh dầu Bạc hà và Hương nhu được khảo sát thành phần bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS. Kết quả thành phần các chat trong tinh dầu được thé hiện
trong Bảng 4.3 và Bảng 4.4.
25
Bảng 4.3. Thành phần tinh dầu Bạc hà
Stt Rt Tén Hàm lượng (%) Độ tương hop (%) 1 5,64 ơ-PInene 0,97 20,2
2 6,44 Sabinen 0,33 58,8 3 6,52 ÿB-Pmene 1.17 18,9 4 6,8 B-Myrcene 0,79 S77 5 6,95 3-Octanol 2,02 73,1 6 7,7 D-Limonene 1,00 28,1 7 7,77 Eucalyptol 0,37 90,7 8 8,45 y-Terpinene 0,12 33,3 9 9,23 Terpinolene 0,13 20,0 10 11 Neoisopulegol 1,09 39,5 11 11,225 I-Menthone 12,09 26,2 12 1155 Isomenthol 6,89 188 13 12,61 Menthol, (+)- 66,89 20,4 14 12,74 a-Terpineol 0,54 43,1
3 | 13,6¢ MS Hexeny! 0,41 66,8
isovalerate
16 13,91 (4)-Pulegone 2,28 42,5 17 14,34 Piperitone 0,93 67,2 18 18,16 (-)-B-Bourbonene 0,11 88,9 19 18,38 B-Elemen 0,10 24,6 20 18,82 Methyleugenol 0,19 72,4 21 19,22 Caryophyllene 0,61 40,6 22 21,05 Germacrene D 0,70 47,0 23 21,49 B-Cyclogermacrane 0,16 22,0 24 25,96 o-Cadinol 0,11 73,6
Kết qua phan tích thành phan hoa học mẫu tinh dầu Bạc hà nhận diện được 24 chất. Trong đó có 3 chất chiếm hàm lượng cao là Menthol 66,89%, I-Menthone 12,09% và Isomenthone 6,89%. Đây là mẫu tinh dầu tại Tp.Hồ Chí Minh. Đối chiếu với mẫu tính dầu trong nghiên cứu của Trâm và ctv (2021) tại các tỉnh Thái Bình,
Bình Thuận, An Giang có hàm lượng Menthol tương ứng là 62,61%, 53,62%, 59,38% và l-Menthone có hàm lượng tương ứng là 21,06%, 18,81%, 19,54%. Tinh
dầu Bạc hà thu được tại hai địa điểm khác nhau của miền Bắc Ấn Độ có hàm lượng
Menthol đạt 20,25% - 21,33%, l-Menthone đạt 27,10% - 29,41%, Isomenthone dat
4,13% - 10,80%. (Vivek và ctv, 2009). Có thể thấy Menthol và Menthone là những thành phan chính, luôn có trong tinh dầu Bac hà, đây có thé xem là 2 chỉ tiêu quan trọng đề đánh giá chất lượng tinh dầu Bạc hà.
26
Bảng 4.4. Thành phần tinh dầu Hương nhu
Stt Rt Tén Hàm lượng Độ tương hợp
(%) (%)
1 5,64 a-Pinene, (D)- 0,62 21,1 2 5,93 Camphene 0,69 41,7 3 6,44 Sabinen 0,13 47,4 4 6,51 Nopinen 0,56 22.3 5 6,56 Amyl vinyl carbinol 0,12 85,0 6 7,69 D-Limonene 0,45 35,9 7 7,76 Eucalyptol 0,14 85,0 8 8,45 y-Terpinene 0,13 36,7 9 9,24 Isoterpinolene 0,17 10,9 10 9,58 Linalool 1,41 89,1 11 10,83 (+)-2-Bornanone 0,11 38,5 12 11,09 Isomenthone 0,25 29,8 13 11,58 endo-Borneol 3,96 56,1 14 11,75 Menthol, (+)- 2,98 19,3
15 11,85 (-)-4-Terpineol 0,24 51,3 16 12,24 a-Terpinol 0,10 48,7 17 17,04 ơ-Cubebene 0,29 30,3 18 17,49 Eugenol 5,74 392 19 17,91 alfa,-Copaene 3,16 226 20 18,16 (-)-B-Bourbonene 1,41 74,0 21 18,49 B-Elemen 9,69 23,2 22 19,57 Methyleugenol 48.53 62,4 23 20,4 Humulene 2,98 56,9 24 21,26 Germacrene D 930 47,8 25 21,92 8-Isopropenyl-1,5- 4,73 7,66
dimethyl-cyclodeca- 1,5-diene
26 22,34 Cadina-1(10),4- 0,90 28,7 diene
27 24,02 Epoxycaryophyllene 0,62 67,9 28 26 Neointermedeol 0,59 26,6
Kết qua phân tích thành phan hóa hoc mẫu tinh dầu Huong nhu trang nhận diện được 28 chất. Trong đó có 4 chất chiếm hàm lượng cao là Methyleugenol 48,53%, B-Elemen 9,69%, Germacrene D 9,30% và Eugenol 5,74%. So với mẫu tinh dầu Hương nhu tại phía Bắc Việt Nam theo nghiên cứu của Dung và ctv (2021) có 27 thành phần với hàm lượng Eugenol 65,13%, Germacrene D 12,03%, nghiên cứu của Nguyễn Phương Hạnh và ctv (2022) có 23 thành phần, trong đó thành phần chính là Eugenol 80,38%, Germacrene D 5,79%, B-Caryophyllene 3,31%. Mẫu tinh dầu
27
Hương nhu tại Benin, kết qua phân tích cho thấy thành phan trong tinh dầu chủ yếu là
các Monoterpene như: p-Cymene (28,08 — 53,82%), Thymol (3,32 — 29,13%), và B-
Myrcene (4.24-8,28%) va hầu như không phát hiện có Eugenol (Kpadonou Kpoviessi và ctv, 2012). Có thể thấy thành phần và hàm lượng tinh dầu giữa các nghiên cứu rất khác nhau vì thành phan tinh dầu rat dé bị ảnh hưởng bởi khí hậu, thời tiết và loại đất, từ đó quyết định chất lượng của tinh dầu. Mùa và thời điểm thu hoạch và thời tiết có thé cũng làm thay đổi mùi của tinh dầu.
4.2. Xác định tỉ lệ phối trộn và thời gian pha trà phù hợp 4.2.1. Đánh giá cảm quan để chọn ra tỉ lệ phối trộn
Các nguyên liệu sử dụng dé làm trà đã được xác định độ âm, đảm bao độ ẩm trà dưới 10% nhằm đảm bảo chất lượng và thời gian bảo quản sản pham. Trà với các tỉ lệ phối trộn khác nhau giữa Bạc hà và Hương nhu được tiến hành đánh giá cảm quan nhằm chọn ra tỉ lệ trà ngon nhất từ đó tiến hành thí nghiệm tiếp theo dé chon ra thời
gian pha trà phù hợp.
i iV
A
Hình 4.9. Mẫu trà các tỉ lệ A (10:0), B (9:1), C (7:3), D (5:5), E (3:7), F (7:3).
Bang 4.5. Kết quả đánh giá cảm quan trà ở các tỉ lệ
Nghiệm thức Điểm cảm quan trung bình A (10:0) 5,10° + 1,86
B (9:1) 5,63° + 1,69 C (7:3) 7,238 + 0,93 D (5:5) 5,87° + 1,22 E (3:7) 6,20 + 1,42 F (0:10) 5,70° + 1,74
28
Trong cùng một cội, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mặt thông kê (P<0,05). -
Kết quả từ Bảng 4.5 cho thay tỉ lệ C (7:3) có điêm cam quan trung bình cao
nhất với 7,23 điểm. Từ đó có thé thấy rang tỉ lệ C được số đông người dùng thử cho
cảm nhận tôt nhât so với các tỉ lệ còn lại.
4.2.2. Hàm lượng Terpenoid, Polyphenol, Flavonoid trong các tỉ lệ Bảng 4.6. Tương quan giữa Menthol và giá trị mật độ quang ở 560 nm
Nông độ Menthol (ug/ml) 20 40 60 80 100
Abs (560 nm) 0,069 0,171 0,293 0,423 0,557
Dựa vào tương quan giữa nồng độ Menthol và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 560 nm, tiến hành xây dựng đường chuẩn Menthol dé xác định hàm lượng
Terpenoid có trong trà.
Menthol
0,6
-®
kế y =0,0061x -0,0658 .
: 0.4 R?=0,9974 „.®
Š 0,3 -
a Oe es
0,1 sứ 0
0 20 40 60 80 100 120
Nông độ Menthol (g/ml)
Hình 4.10. Đường chuẩn Menthol.
Dựa vào đường chuẩn Menthol dé xác định hàm lượng Terpenoid theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0061x — 0,0658 với R? = 0,9974.
Bảng 4.7. Tương quan giữa Gallic acid và giá trị mật độ quang ở 760 nm
Nông độ
ơơ 10 20 30 40 50 60 Gallic acid (ug/ml)
Abs (760 nm) 0,154 0,292 0,452 0,579 0,726 0,863
29
Dựa vào tương quan giữa nồng độ Gallic acid và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 760 nm, tiến hành xây dựng đường chuẩn Gallic acid để xác định hàm
lượng Polyphenol có trong trà.
Gallic acid
1
0.8 y=0,0142x + 0,0136
=) R?=0.9994 :
S, s-Ne)
a 0.4 r
Oo
< - 0,2 gi
@
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Nông độ Gallic acid (ug/ml)
Hình 4.11. Đường chuẩn Gallic acid.
Dựa vào đường chuẩn Gallic acid dé xác định hàm lượng Polyphenol theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0142x + 0,0136 với R? = 0,9994.
Bảng 4.8. Tương quan giữa Quercetin và giá trị mật độ quang ở 415 nm
Nông độ
20 40 60 80 100 Quercetin (tg/m])
Abs (415 nm) 0,125 0,226 0,349 0,459 0,606
Dựa vào tương quan giữa nồng độ Quercetin và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 760 nm, tiến hành xây dựng đường chuẩn Quercetin để xác định hàm
lượng Flavonoid có trong trà.
30
Quercetin
0.7
0.6 2 y = 0,006x - 0,0055 ie 0.5 R? = 0,996
415 nm) 0.4
Absằ 03 0,2 0.1
0 20 40 60 S0 100 120 Nông độ Quercetin (ug/ml)
Hình 4.12. Đường chuẩn Quercetin.
Dựa vào đường chuẩn Quercetin đề xác định hàm lượng Flavonoid theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,006x — 0,0055 với R? = 0,996.
Bảng 4.9. Kết quả hàm lượng Terpenoid, Polyphenol, Flavonoid ở các tỉ lệ
Nghiệm Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng thức Terpenoid (mg/g) Polyphenol (mg/g) Flavonoid (mg/g) A (10:0) 25,722 + 0,58 19,662 + 0,11 9,41^+ 0,12
B (9:1) 23,437 + 0,55 19,02% + 0,12 9,072+0,11 C (7:3) 19,44P + 0,53 18,44° + 0,16 8,32 + 0,12
D (5:5) 15,12° + 0,67 17,23° + 0,15 7,62° + 0,13
E (3:7) 10,244 + 0,26 14,454 + 0,20 6,51+ 0,14
F (0:10) 6,89 + 0,36 4,61°+0,14 2,11°+ 0,10
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mat thông kê (P<0,05).
Nghiệm thức từ A đến F cho thấy kết quả hàm lượng Terpenoid, Polyphenol và Flavonoid có xu hướng giảm khi giảm dan tỉ lệ Bạc hà và tăng dan tỉ lệ Hương nhu.
Ở nghiệm thức A, thành phần trà túi lọc chỉ có Bạc hà với hàm lượng Terpenoid là
25,72 mg/g, Polyphenol là 19,66 mg/g và Flavonoid là 9,41 mg/g, trong khi ở nghiệm thức F chỉ có Hương nhu với hàm lượng Terpenoid 6,89 mg/g, Polyphenol là 4,61
31
mg/g va Flavonoid 2,11 mg/g. Như vậy có thé thấy rõ hàm lượng Terpenoid, Polyphenol và Flavonoid của Hương nhu thấp hơn nhiều so với Bạc hà, điều đó cũng có nghĩa việc thay đồi tỉ lệ giữa Bạc hà và Hương nhu sẽ có ảnh hưởng lớn đến ham lượng hợp chất trong trà.
4.2.3. Đánh giá cảm quan để chọn ra thời gian pha hỗn hợp phối vị phù hợp Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan qua các tỉ lệ và hàm lượng Terpenoid, Polyphenol, Flavonoid thì nghiệm thức C (7:3) có điểm số trung bình cao nhất, hàm lượng các chất cũng tương đối cao so với các tỉ lệ còn lại. Vì vậy nghiệm thức C (7:3) đươc lựa chọn đề đánh giá cảm quan ở giai đoạn 2, nhằm chọn ra thời gian pha trà phù hợp nhất.
Bảng 4.10. Kết qua đánh giá cảm quan trà ở các thời gian
Thời gian pha trà Điểm chat lượng
5 phút 16,58
10 phút 17,90
20 phút 16,17
Sau khi khảo sát cảm quan trà trên 30 người, điểm đánh giá cảm quan cao nhất của trà Bạc hà và Hương nhu ở tỉ lệ C cho điểm chất lượng cao nhất ở 10 phút. Theo cảm nhận của người thử trà. Trà có màu nâu đỏ, dễ uống, mùi thơm nhẹ, vị thanh dễ chịu, cảm giác the mát. Với mức điểm 17,90 trà được xếp vào loại khá.
4.2.4. Hàm lượng Terpenoid, Polyphenol, Flavonoid trong từng thời gian
32
Bảng 4.11. Kết quả hàm lượng Terpenoid, Polyphenol, Flavonoid qua các thời gian
Thời gian 5 phút 10 phút 20 phút
Ham lượng 18,02° + 0,51 23,48? + 0,83 20,80° + 0,42
Terpenoid (mg/g)
Ham luong é b h
Feiyshenal tunis 18,27°+ 0,11 19,54> + 0,13 20,18*+ 0,11
Hàm lượng 8,22° + 0,06 8,89° + 0,05 9.192 + 0,04
Flavonoid (mg/g)
Trong cùng một hàng, các giả trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mặt thông kê (P<0,05).
Từ kêt qua Bang 4.11 cho thay hàm lượng Polyphenol, Flavonoid đêu tăng dân
theo thời gian pha trà, riêng hàm lượng Terpenoid ở thời gian 5 đến 10 phút có xu hướng tăng từ 18,02 + 0,51 mg/g đến 23,48 + 0,83 mg/g nhưng không tiếp tục tăng như hàm lượng Polyphenol, Flavonoid mà giảm xuống đến 20,80 + 0,42 mg/g. Điều này có thé giải thích rằng Terpenoid là một nhóm chat dé bay hơi khi gặp nhiệt độ cao, với nhiệt độ pha trà khoảng từ 95 — 100°C, trong thời gian 10 phút đầu là lúc Terpenoid trong bột trà tiết ra mạnh nhất, nhưng thời gian từ 10 phút đến 20 phút khi Terpenoid trong bột trà đã tiết ra hết sẽ bay đi dần trong không khí khiến hàm lượng trong mẫu nước trà giảm đi. Hầu hết người đánh cảm quan cho nhận xét rằng mẫu trà
được pha trong 10 phút có mùi thơm hơn so với các thời gian pha còn lại.
4.2.5. Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật
Bảng 4.12. Kết quả kiêm tra vi sinh vật sản phẩm trà túi lọc Bạc hà và Hương nhu
Giới hạn cho
STT Chỉ tiêu Kết quả Phương pháp thử nhên
| Tông vị lân / 2,4x 101 TCVN 4884:2005 1x 10°
3 in nắm men Không phát hiện TCVN 8275 -1:2010 1x 10!
3 ae nam mộc Không phat hiện TCVN 8275 -1:2010 1x 10!
4 pi ơ Khụng phat hiộn TCVN 6848:2007 1x 10°
5 eae: " *PP- Khôngpháthiện TCVN4829:2005 =- a
33
Căn cứ theo TCVN 7975:2008 về chè thảo mộc túi lọc thì sản pham trà túi lọc Bạc hà và Hương Nhu đạt yêu cầu về vi sinh trong thực phẩm.
4.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trong hỗn hợp phối vị
Từ kết quả đo mật độ quang tại bước sóng 517 nm và tính toán kết quả hoạt tính chống oxy hóa của Ascorbic acid vả mẫu trà tỉ lệ C (7:3), xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nông độ chất khảo sát có dạng y = ax + b. Trong đó, y là hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ chất khảo sát. Thay giá trị y = 50, vào phương trình hồi quy xác định được giá trị ICso tương ứng. Thí nghiệm được thực hiện và tính toán với 3 lần lặp lại độc lập. Kết quả xác định giá trị ICso được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 4.13. Kết quả khảo sát ICso theo phương pháp DPPH
Chất khảo sát — Phương trình hồi quy ICso (ug/ml)
Ascorbic acid y = 3,78x + 0,6045 R?=0,9989 13,07 + 0,23
Mau C (7:3) y =0,7912x+11,6 R?=0,9942 48,54 + 0,08 Kết qua được thé hiện dưới dang giá trị trung bình (+ SEM).
Hoạt tính chống oxy hóa của mau trà C xác định được là 48,54 + 0,08 ug/ml, của đối chứng Ascorbic acid là 13,07 + 0,23 ug/ml, như vậy hoạt tính chống oxy hóa của mẫu trà C thấp hon Ascorbic acid 3,71 lần. Vì Ascrobic acid được biết đến là một chất chống oxy hóa mạnh dong thời trạng thái sử dụng trong thí nghiệm là một chat có độ tinh khiết cao, so với mẫu trà chỉ là một dịch chiết thô không qua tinh chế.
Song song đó, kết quả được xem là phù hợp khi so sánh với dữ liệu nghiên cứu trước đây về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Bạc ha cho thấy ICso = 41 ug/ml, của Ascorbic acid ICso = 19 pg/ml (Biswas và ctv, 2014), địch chiết Hương Nhu cho kết
quả ICso = 12,3 ug/ml, của Ascorbic acid ICso = 4,9 ug/ml (Awah và ctv, 2010).
Mẫu trà nghiên cứu có hoạt tính chống oxy hóa cao hon tra túi loc ban ICso = 67,59 g/ml (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2020), thấp hon trà Dinh hương ICso = 30,0
ug/mL (Lee va ctv, 2005), trà đen ICso = 28,40 pg/ml (Chang va ctv, 2020).
34