2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 08 năm 2022 đến tháng 02 năm 2023 tại phòng thi
nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật và trại thực nghiệm khoa Nông học, Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và định danh một số loài nắm rễ nội cộng sinh từ đất trồng cây họ cà.
Nhân nuôi một số loài nam rễ đã phân lập được trên các cây kí chủ khác nhau.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm bộ rây đất với các mức rây: 25, 32, 41, 250, 1000 um. Máy ly tâm (HERMLE Z306, Germany), kính hiển vi quang học (CKX53, Japan), kính hiển vi (CX23, Japan), cân điện tử (PX OHAUS), may lac (IKA HS260). Hóa chat được sử dung trong nghiên cứu bao gồm đường sucrose 50%
(50%, Việt Nam), trypan blue 0,05% (0,05%, Đức), KOH 10% (10%, Việt Nam), acid
acetic (Trung Quốc).
Vật liệu thí nghiệm là rễ và mẫu đất vùng rễ cây cà chua giống Rita từ 50 tới 65 ngày tuôi. Mỗi loại cây được thu ở 5 ruộng, mỗi ruộng thu 5 mẫu. Trong mỗi ruộng, bộ rễ và đất vùng rễ của cây được thu ngẫu nhiên và được trộn đều đại diện cho một lần lặp lại cho mẫu. Các mẫu đất vùng rễ và rễ cây sau khi thu về được xử lý tách đất và rễ
trong phòng thí nghiệm.
26
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Lay mẫu dat
Bước 1: Gat bỏ 3 cm đất bề mặt dé loại trừ vi sinh vật từ thảm mục thực vật vavi
sinh vật bê mặt.
Bước 2: Dùng xẻng đã được vô trùng bằng cồn đào lấy phần bầu đất quanh rễ cây (ở độ sâu 3 — 15 cm), cách gốc khoảng 10 em mỗi mẫu đất khoảng 500 g. Đảo lấy rễ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non. Mẫu đất sau khi được thu thập về phòng thí nghiệm được dé khô tự nhiên trong bóng mát, sau đó được đựng trong hộp nhựa kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2 - 5°C) tối thiểu 4 ngày trước khi sử dụng cho phân tích hoặc nuôi cấy.
2.4.2 Phân lập nắm rễ nội cộng sinh trong dat trồng cây họ cà
Arbuscular Mycorrhizal được phân lập bằng phương pháp sàng ướt kết hợp với
phương pháp tách đơn bào tử.
Bước 1: Trộn một lượng đất 100 g trong nước 500 ml dé trong thời gian 20 phút cho phép các hạt nặng hơn lắng xuống tạo dung dịch huyền phù.
Bước 2: Dé chất lỏng qua sàng có kích thước 1000 um để loại bỏ các hạt lớn và xác bã thực vật. Thu chất lỏng đi qua sàng. Rửa sàng dưới vòi nước để tất cả các vật liệu
nhỏ đã lọt qua.
Bước 3: Khuấy đảo nhẹ nhàng các hạt trong chất lỏng đã đi qua sàng thô và cho phép các hạt nặng hơn lắng xuống trong vài giây.
Bước 4: Tiếp tục lọc qua sàng 250 um.
Bước 5: Rửa vật liệu giữ lại trên sàng dé đảm bảo rằng tất cả các vật liệu có kích
cỡ nhỏ hơn 250 um đã di qua sang.
Bước 6: Tiép tục loc qua sang 32, 25 um. Rửa vật liệu giữ lại trên sang.
Bước 7: Chuyên phần vật chất dư lại trên sàng ở các kích cỡ khác nhau phía trên vào ống chứa dung dịch nước cất. Ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 2500 vòng/phút.
27
Bước 8: Bỏ phan dung dịch nước cất. Cho dung dịch đường nồng độ 50% và tiếp tục ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 2500 vòng/phút.
Bước 9: Thu phần dịch trong vào bình Dural, lấy dần ra đĩa Petri và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học.
Bước 10: Quan sát, tách bào tử đơn độc dưới kính hién vi, sử dung pipet Pasteur.
2.4.3 Phương pháp nhuộm bào tử
Dung dịch nhuộm bảo tử: Dung dịch polyvinyl — lactose — glycerol (PVLG): 100
mL nước cất + 100 mL acid lactic + 10 mL glycerol + 16,6 g polyvinyl alcohol, hỗn hop được đặt trên bếp từ và khuấy đều ở nhiệt độ 60°C trong 4 giờ.
Dung dịch thuốc thử Melzer: 100 mL nước cất + 100 g chloral hydrat + 1,5 g iodine + 5 g potassium iodide, trữ trong chai tối.
Cách tiến hành: Nhuộm bào tử bằng cách nhỏ hai giọt dịch nhuộm lên hai đầu lamen (một giọt PVLG và một giọt PVLG + Melzer), mỗi giọt có khối lượng tối đa 0,1 — 0,2 g, đặt 5 bao tử có cùng chi vào trong giọt dịch nhuộm, để 5 phút cho khô bề mặt. Sau đó đậy lame lên giọt dịch có chứa bào tử nam rễ thật nhẹ, dùng đầu kim cấy ấn trực tiếp lên lamen ngay vị trí của từng bào tử riêng lẻ. Mẫu cố định được dé yên 24 giờ sau đó quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có vật kính 40X, mỗi bào tử có thê bị vỡ ở các mức độ khác nhau, đo đó, có thể quan sát được cấu trúc bên trong của chúng.
2.4.4 Định danh nắm rễ nội cộng sinh bằng đặc điểm hình thái
Bào tử nhuộm bằng dung dịch thuốc thử Melzer. Từng bào tử đơn độc được quan sát, phân tích trước và sau khi nhuộm chất thử cua Melzer dưới kính hiển vi. Nhận biết bào tử dựa vào mau sắc bào tử, kích thước, bề mặt và cau trúc vách, đối chiếu các mô tả và hình ảnh trong khóa phân loại của Bảo tàng nắm Mycorrhiza Quốc tế của Đại học
West Verginia va Schenck, Pertez, 1990.
Định danh nam rễ nội cộng sinh theo các chi là chi Scutellospora (Walker và
Sanders, 1986), chi Rhizophagus (Walkerva SchũBler, 2010), chỉ Acaulospora (Gerd va
28
Trappe emend Berch, 1974), chỉ Archaeospora (Morton và Redecker, 2006), chi Cetraspora (Oehl va ctv, 2007), chi Glomus (Tul va ctv, 2010), chi Gigaspora (Gerd va Trappe, 1995), chi Paraglomus (Morton va Redecker, 2001).
Định danh chi nam rễ xuất hiện nhiều nhất trong các mau khảo sát.
2.4.5 Nhân nuôi nắm rễ nội cộng sinh trong đất trồng cây họ cà trên cây bắp, lúa
và cà chua (INVAM)
Chuẩn bị giá thé nhân nuôi: Ngâm xo dừa qua 24 giờ dé loại bỏ thành phan độc tố có trong sơ dừa. Khử trùng giá thể (gồm cát và xơ dừa) bằng nồi hấp tiệt trùng liên tục trong 3 ngày, mỗi ngày hấp 2 lần dé loại bỏ các vi sinh vật có trong giá thé. Mẫu giá thé sau trộn (tỉ lệ 5 cát : 1 xơ dừa) chuyền sang các chậu sạch (đã được thanh trùng). Thí nghiệm trồng cây sử dụng chậu nhựa den (bán kính đáy lớn R = 30 cm, đáy bé r = 20 em, chiều cao h = 20 cm). Các chậu giá thé được chuẩn bị tiến hành chủng các quan thé bào tử
nam ré và trông cây.
Xử lý hạt giống: Các hạt giống ngô F1, cà chua, lúa được làm sạch bang Ethanol 70% (3 lần) và cuối cùng làm sạch lại bằng nước cất vô trùng (3 lần). U hạt, kiểm tra và thêm nước tránh hạt bị khô. Hạt nhú mầm được sử dung dé trồng cho thí nghiệm chủng bao tử. Gieo hạt vào giá thé trồng, tưới cây bằng nước cất vô trùng mỗi ngày. Các mẫu giá thể vùng rễ các loại cây được chia thành các nghiệm thức thí nghiệm lần lượt nghiệm thức Đối chứng, nghiệm thức chủng 5, 10, 15 bào tử/chậu. Cham sóc cây trong điều kiện thiếu dinh dưỡng dé đánh giá tác động của nam rễ nội cộng sinh lên cây. Thu hoạch cây sau 1,2 và 4 tháng nuôi cay. Đếm số lượng nam AM có trong rễ và trong 100 g giá thé trồng cây. Nhuộm rễ bằng Trypan blue.
Chuan bị nguồn bào tử nam rễ
Chi Gigaspora: Các bao tử nam sau được khi phân lập được chủng trực tiếp vào các cây sau 5 ngày trồng từ các mẫu đất được thu tại 3 huyện, tỉnh Lâm Đồng.
Chi Rhizophagus: Nguồn nam được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông Học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
29
Tach các mâu ré đã nhân nuôi thành công chi Rhizophagus, đảm bao bao tử còn nguyên vẹn và cộng sinh được với rê cây trông.Các bảo tử nam sau khi tách ra khỏi ré
được chủng vào vùng rễ cây trồng.
Bồ trí thí nghiệm
Nghiệm thức đối chứng (DC): giá thể thanh trùng + không chủng nam rễ Nghiệm thức Ngô 1: giá thể thanh trùng + chủng 5 bào tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Ngô 2: giá thé thanh trùng + chủng 10 bào tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Ngô 3: giá thể thanh trùng + chủng 15 bào tử nắm rễ/chậu Nghiệm thức Lúa 1: giá thé thanh trùng + chủng 5 bào tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Lúa 2: giá thé thanh trùng + chủng 10 bao tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Lúa 3: giá thé thanh trùng + chủng 15 bao tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Cà chua 1: giá thé thanh trùng + chủng 5 bào tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Cà chua 2: giá thé thanh trùng + chủng 10 bào tử nam rễ/chậu Nghiệm thức Cà chua 3: giá thé thanh trùng + chủng 15 bào tử nam rễ/chậu
Chăm sóc cây trong điều kiện thiếu dinh dưỡng để đánh giá tác động của nam rễ
nội cộng sinh lên cây.
Chỉ tiêu theo dõi
Theo dõi sự sinh trưởng của 3 loại cây đã trồng ở các thời điểm 1 tháng, 2 tháng và 4 tháng sau khi chủng. Ở giai đoạn thu hoạch, đếm số lượng nắm cộng sinh có trong
100 g đất trồng.
Bào tử nắm rễ sau khi nhân nuôi trên các loại cây được tổng hợp bằng phần mềm Microsoft Excel (Microsoft office 10) và xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1.
30
Chương 3