2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ thang 02 năm 2022 đến tháng 08 năm 2022, tại Trường Dai học Nông Lâm TP. Hồ Chi Minh và xã Long Khê, huyện Can Đước, tinh Long An.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá tính gây bệnh của nam R. solani trên một số loại cải trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng đối kháng với nắm R. solani của một số dòng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng phòng trừ với nắm R. solani của hai dòng xạ khuẩn trong điều kiện nhà lưới; Đánh giá khả năng trừ bệnh của hai dòng xạ khuẩn ngoài đồng.
- Định danh hai dòng xạ khuẩn có hiệu suất đối kháng cao nhất.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Nguồn nam R. solani: Mẫu bệnh được thu thập trên một sé cay trong nhu cai xanh, cải ngot,... ở các huyện Can Đước, Cần Giuộc, tinh Long An.
- Nguồn xạ khuẩn: 11 dòng xạ khuẩn được cung cấp bởi Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh (Bảng 2.2).
- Trang thiết bị: Tủ cay khử trùng, máy hap khử trùng bằng hơi nước nóng (121°C trong 20 phút), tủ say khử trùng, kính hiển vi quang hoc Olympus CX31, cân điện tử, bếp điện, lò viba, đĩa pétri (loại thủy tinh 90 x 15 mm), cốc thủy tinh (250 mL, 500 mL),
- Các môi trường dinh dưỡng: Môi trường PDA (20 gram dextrose, 20 gram
agar và 200 gram khoai tây, nước cất vừa đủ 1000 ml); Môi trường MEA (20 gram malt extract (mạch nha), 20 gram agar, nước cất vừa đủ 1000 ml); Môi trường WA (nước cất 1000ml, 20 gram agar); Môi trường Gause I (20 gram tinh bột; 0,5 gram
MgSOxa.7H2O; 0,5 gram K2HPOs; 1 gram KNOs; 0,5 gram NaCl; 0,01 gram
FeSO..7H20; 20 gram agar, nước cat đủ 1000 ml).
Bang 2.1. Đặc điểm của 11 dòng xạ khuẩn thí nghiệm
aialal hiệuký Nguồn gốc Đặc điểm hình thái
Mẫu đất tại Khuẩn lạc màu trắng, tròn, dạng 1 PBOI tinh Bến phóng xạ. Khuẩn ty cơ chất có Tre màu cam và nhạt dần về phía rìa.
Mau đất tại Khuan lạc màu trắng xám và có 2 B102 tỉnh Bến hình dạng phóng xạ. Khuẩn ty cơ
Tre chất có màu tím hoặc trắng
Mẫu đất tại : , .
. Khuân lac màu trăng xám. Khuan
3 BT03 finhHến k
ty cơ chât có màu nâu vàng.
Tre
Mẫu dat tai Khuẩn lạc có màu trắng xám.
4 BT06 tỉnhBến Khuẩn ty cơ chất có màu nâu
Tre vàng.
Mẫu đất tại Khuan lạc có màu trang, tron, 3 B107 tỉnh Bến dạng phóng xạ. Khuẩn ty cơ
Tre chất có màu trắng ngà.
10
1]
BT08
BT09
BT11
BT13
BT14
BT16
Mẫu đất tại tỉnh Bến
Tre
Mẫu đất tại tỉnh Bến
Tre
Mẫu đất tại tỉnh Bến
Tre
Mẫu đất tại tỉnh Bến
Tre
Mẫu đất tại tỉnh Bến
Tre
Mẫu đất tại tỉnh Bến
Tre
Khuân lạc có màu trăng xám.
Khuân ty cơ chât có màu nâu vàng.
Khuan lạc màu trắng xám, tâm lồi rõ, mép dạng răng cưa và có viền màu xám. Khuẩn ty cơ chất
mảu nâu vàng.
Khuẩn lac màu trắng, tròn, dạng phóng xạ. Khuan ty cơ chất có màu trắng ngà.
Khuân lạc màu trắng xám và có hình dạng phóng xạ. Khuân ty cơ chât có màu tím hoặc trăng
Khuan lạc màu xám đen, bê mặt lôi, xung quanh có vòng phóng xạ.
Khuân ty cơ chât có màu nâu vàng.
Khuân lạc có màu trăng, tròn, dạng phóng xạ. Khuân ty cơ chât có mảu trăng ngà.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thu thập mẫu, phân lập, định danh nắm R.solani 2.4.1.1. Phương pháp thu mẫu
Tiến hành thu thập các mẫu bệnh có triệu chứng điển hình do nam R. solani gây hại trên cây trồng họ thập tự. Các mẫu bệnh được bảo quản trong hộp nhựa, sau khi thu thập, mẫu bệnh được mang về phòng thí nghiệm dé xác định.
Bảng 2.2. Danh sách mẫu nam bệnh phân lập từ các mẫu bệnh thu thập
ar SY VaufBibiak 1mjvdfmihumneu “oem
trong : Kiểu : bệnh
I Cai xanh Cô rễ Can Đước, Long An CX-CD 2 Caingot Cô rễ Cần Giuộc, Long An CN-CG 3 _ Cải thìa Cô rễ Cần Giuộc, Long An CT-CG
2.4.1.2. Phương pháp phân lập
Các mẫu bệnh có triệu chứng bệnh điển hình được quan sát và chọn can thận, sau đó rửa đưới vòi nước để loại bỏ các tạp chất và bụi bân. Dùng dao đã khử trùng bằng đèn cồn cắt mẫu bệnh thành từng miếng nhỏ (1 — 2 mm) tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Mẫu bệnh được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trong vòng 30 giây, rửa qua bằng nước cat vô trùng 3 lần và sau đó thấm khô mẫu bệnh bằng giấy thấm vô trùng. Dùng kẹp đã khử trùng cấy các mẫu bệnh vào môi trường WA. Các dia được dé ở nhiệt độ 27 + 2°C và quan sát mỗi ngày. Khi tản nam phát triển (1 — 2 cm) trên môi trường WA quan sát sợi nam của tan nam có đặc điểm hình thái đặc trưng của nắm bệnh tiễn hành tách và làm thuần nắm bệnh trên môi trường PGA.
2.4.1.3. Định danh loài nam R. solani từ các mẫu phân lập dựa vào đặc điểm hình thái Định danh loài nam Rhizoctonia solani dựa vào các đặc điểm về hình thái như mau sắc, đặc điểm tan nam, đặc điểm sợi nắm, hình dạng và màu sac hạch nam dựa
theo khóa phân loại của Ogoshi (1975); Sneh (1991); Zheng (2011).
Phương pháp định danh nam Rhizoctonia solani theo mau sắc, đặc điểm phát triển tản nam, hạch nam: tat cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường MEA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 7 ngày nuôi cấy ghi nhận
Phương pháp định danh nắm Rhizoctonia solani theo đặc điểm sợi nam: Tất cả các MPL nuôi cấy trên môi trường MEA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 3 ngày nuôi cấy tiến hành làm tiêu bản để quan sát đặc điểm sợi nắm dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40X.
2.4.2. Đánh giá tính gây bệnh của các MPL nam R. solani trên một số loại cải trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm tiễn hành đánh giá trên 3 loại cải xanh, cải ngọt và cải thìa được thực hiện trong đĩa pétri (90 x 15 mm) theo phương pháp của Keijer va cs (1997). Ba mẫu phân lập (MPL) R. solani dai diện cho 2 nhóm nam (nhóm có hạch và nhóm không hạch) được sử dụng dé đánh giá. Môi trường dé thực hiện thí nghiệm là WA, 12 hạt giống của mỗi loại rau được ủ nứt mầm và đặt trên một đường thăng với khoảng cách bằng nhau trên bề mặt thạch. Hai khoanh tản nắm (đường kính 4 mm) được đặt giữa các hạt giống, khoanh môi trường WA được sử dụng đối chứng, 3 lần lặp lại. Dùng giấy bạc bọc một nửa đĩa pétri dé ngăn ánh sáng chiếu vào rễ và đặt nghiêng một góc 60°. Các đĩa pétri được dé trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ 28 + 2°C, 12 giờ sáng, 12 giờ tối.
Theo dõi hàng ngày ghi nhận thời gian xuất hiện vết bệnh (ngày), tỉ lệ bệnh (%) được đánh giá 1 lần tai thời điểm 5 ngày sau chủng bệnh theo công thức:
TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây theo dõi.
Cấp bệnh (chỉ số bệnh) là đại lượng đặc trưng cho mức độ bị hại của cây trồng được chia thành 5 cấp theo Carling và cs, (1999):
Cấp 0: không có triệu chứng bệnh - không gây bệnh; Cấp 1: Tru hạ điệp hơi mat màu — gây bệnh nhẹ; Cấp 2: Trụ hạ điệp mat màu và các vết bệnh nhỏ (đường kính <Imm) trên than, trụ hạ diép, lá hoặc rễ - gây bệnh nhẹ; Cấp 3: Trụ hạ diệp mat màu và các vết bệnh lớn (đường kính >1mm) trên thân, tru hạ diép, lá hoặc rễ - gây bệnh nặng.; Cấp 4: Cây con chết — gây bệnh nặng.
2.4.3. Đánh giá kha năng đối kháng R. solani của một số dòng xạ khuẩn trong điều
kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố gồm 12 nghiệm thức, tương ứng với 11 dòng xạ khuẩn và 1 đối chứng (nam R. solani được nuôi trong đĩa pétri chứa môi trường PDA không xạ khuẩn), mỗi nghiệm thức 03 đĩa pétri, 3 lần lặp lại.
Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn va nam: xạ khuẩn và nam được nuôi cấy trên môi trường PDA 7 ngày sau đó tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cấy kép. Xạ khuẩn được cấy thành hai đường thắng song song bằng que cấy vòng trên đĩa pétri chứa 10 ml môi trường PDA. Sử dụng dụng cụ đục lỗ đường kính 4 mm lấy khoanh nấm chuyển vào giữa đĩa pétri đã cấy xạ khuẩn. Đĩa pétri được đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng và đánh giá kha năng đối kháng của các dòng xạ khuẩn với nam R. solani bằng cách đo đường kính tản nam và tính hiệu suất đối kháng ở thời điểm 24, 48 và
72 giờ sau thí nghiệm.
Hiệu suất đối kháng (HSDK) được tính toán theo Palaniyandi va cs, (2011): Hiệu suất đối kháng (%) = ((G1-G2)/G1) x 100%. Trong đó: G1 là đường kính tan nam ở nghiệm thức đối chứng ; G2 là đường kính tản nam ở nghiệm thức có xạ khuẩn.
Mức độ đối kháng được đánh giá theo Lee va Hwang (2002) dựa vào hiệu suất đối kháng như sau: Hiệu quả rất mạnh: 76-100%; Hiệu quả mạnh: 51-75%; Hiệu quả
trung bình: 26-50%; Hiệu quả kém: 1-25%; Không hiệu quả: 0%.
2.4.4. Đánh giá khả năng phòng trừ nam R. solani của xạ khuẩn trong điều kiện
nhà lưới
2.4.4.1. Đánh giá khả năng phòng bệnh do nam R. solani của xạ khuẩn điều kiện
nhà lưới
Phương pháp bố trí thí nghiệm: Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nắm R. solani trong điều kiện phòng thí nghiệm (2.4.3). Chọn 02 dòng xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng phòng bệnh trong điều kiện nhà lưới. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức thực hiện 2 khay, mỗi khay 50 hạt cải xanh, 4 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập.
Các nghiệm thức như sau:
Nghiệm thức 1: hạt không xử lý xạ khuẩn gieo đất sạch (đối chứng âm).
Nghiệm thức 2: hat không xử lý xạ khuẩn gieo đất nhiễm nam bệnh (đối chứng dương).
Nghiệm thức 3 và Nghiệm thức 4: hạt xử lý xạ khuẩn gieo đất nhiễm nắm bệnh.
Nghiệm thức 5: hạt xử lý thuốc trừ bệnh Dithane M45 WP (80% Mancozeb).
Phương pháp thực hiện
Khay hình chữ nhật (68 x 42 x 15 cm) chứa 5 kg giá thể hỗn hợp đất — tro trau
— xơ đừa được trộn theo tỉ lệ 1 — 1 — 1, khử trùng bằng hơi nước nóng 121°C trong 20 phút. Ching 500 hạch nắm ở mỗi khay nhựa (theo từng nghiệm thức) ở độ sâu 1 — 5 cm.
Các khay được bao phủ bằng màng nhựa và ủ trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng đề thúc đây sự phát triển của mầm bệnh.
Chuẩn bị xạ khuẩn: xạ khuẩn được nuôi nhân trong đĩa pétri chứa môi trường Gause I. Sau 7 ngày, tiễn hành bơm 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa, dùng lam (đã thanh trùng) thu sinh khối, và lọc qua vải lược đã thanh trùng thu được sinh khối xạ khuẩn. Pha loãng điều chỉnh mật số 107 cfu/ml.
Cải xanh thực hiện thí nghiệm: Giống cải bẹ xanh mỡ Trang Nông.
Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với Ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút.
Sau đó hạt giống được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng.
Nghiệm thức hạt không xử lý xạ khuẩn: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt, sau đó được làm khô, gieo với độ sâu 1 em vào khay đất theo từng nghiệm thức đối chứng âm, đối chứng dương.
Nghiệm thức hạt xử lý xạ khuẩn: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt ngâm 30 phút trong huyền phù xạ khuẩn mật số 10” CFU/ml, sau đó được làm ráo và gieo với độ sâu 1 em vào đất đã chủng nam.
Nghiệm thức hạt xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt ngâm 30 phút trong mancozeb với nồng độ 4,167 mg/ml và sau đó được lam ráo gieo với độ sâu 1 cm vào đất đã chủng nắm.
Chỉ tiêu theo dõi
- Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết Tạp ở thời điểm 10 ngày sau khi gieo hat. Tỉ lệ bệnh tính theo công thức: TLB (%) = A/B x
100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Khả năng phòng bệnh tính theo công thức (Susilowati và cs, 2011): Khả năng
phòng bệnh (%) = [(C* - C')/(C - C*)] x 100; Trong đó: C là số cây khỏe mạnh trong nghiệm thức; C* là số cây khỏe mạnh trong đối chứng nhiễm bệnh; C- là số cây khỏe mạnh trong đối chứng không bị nhiễm bệnh.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng: Chiều cao cây (cm) đo từ bề mặt giá thé đến chóp lá cao nhất của cây; Chiều dài rễ (cm) đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng của chop rễ đài nhất.
- Trọng lượng tươi và trọng lượng khô: Trọng lượng tươi (g/cây): xác định
bằng cách cân khối lượng cây tươi. Trọng lượng khô (mg/cây): xác định bằng cách cân sau khi sấy ở nhiệt độ 50°C cho đến khi khối lượng không đồi.
2.4.4.2. Đánh giá khả năng trừ bệnh do nắm #. solani của xạ khuẩn điều kiện
nhà lưới
Thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 4 nghiệm thức (2 nghiệm thức xử lý xạ khuẩn, 1 nghiệm thức xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb, 1 đối chứng phun nước), mỗi nghiệm thức thực hiện 2 khay, mỗi khay trồng 15 cây cải xanh, 4 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập.
Cải xanh thực hiện thí nghiệm: Giống cải bẹ xanh mỡ Trang Nông.
Mỗi khay chứa 5 kg giá thé đã được hap khử trùng, tiến hành chủng 500 hạch nam R. solani ở mỗi khay nhựa ở độ sâu 1 — 5 cm. Các khay được bao phủ bằng màng nhựa và ủ trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng dé thúc đây sự phát triển của mam bệnh. Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với Ethanol 70% trong 30 giây, tiếp
theo ngâm trong dung dich Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút. Sau đó
hạt giống được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng, sau đó được làm khô, gieo với độ sâu 1 cm vào bau đất đã khử trùng. Tiến hành trồng cây cải xanh 15-20 ngày tudi (3- 4 lá thật) vào khay nhựa đã được chủng nam R. solani.
Thoi diém xir ly: 1 lần, khi cải xanh bat đầu xuất hiện triệu chứng bệnh như héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết rap. Nong độ xạ khuẩn 107 CFU/ml, mancozeb 4,167 mg/ml (liều lượng với xạ khuẩn 18 ml, mancozeb 75 mg/18 ml nước mỗi nghiệm thức).
Chỉ tiêu theo dõi
Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cô rễ, chết rap 0 các thời điểm 3, 7 va 14 ngày sau khi phun xử ly và tinh theo công thức:
- Tỉ lệ bệnh tính theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức Henderson - Tilton:
E(%) = {1-[(Ta x Cb)/(Tb x Ca)]} x 100
Trong đó: E: Hiệu luc phòng trừ; Ta: Ti lệ bệnh mới phat sinh ở công thức xử
lý thuốc tại thời điểm sau xử ly; Tb: Ti lệ bệnh công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý; Ca: Tỉ lệ bệnh mới phát sinh ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý; Cb: Tỉ lệ bệnh ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lý.
- Diện tích bên dưới đường cong tích lũy bệnh AUDPC (Area Under Disease Progressive Curve) được tính theo công thức (Cooke, 2006):
AUDPC=}?-:[(Yi + Yi + 1)/2]x (Tj + 1 — Tỷ)
Trong đó: n tong số ngày theo dõi, i ngày theo dõi thứ ¡, Y; tỉ lệ bệnh ngày thứ ¡, YĂ:Ă Tỉ lệ bệnh ngày thứ ù+1, Tj — T; thời gian giữa 2 lần theo dừi.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng: Chiều cao cây (cm); Số lá/cây; Chiều dài lá (cm);
Chiều rộng lá (cm); Chiều dài rễ (cm).
- Chỉ tiêu về năng suất: Trọng lượng tươi (g/cay), trọng lượng 6 thí nghiệm (g).
2.4.5. Đánh giá khả năng trừ bệnh lở cỗ rễ của xạ khuẩn ngoài đồng
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 4 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, trong đó 2 nghiệm thức xử lý xạ khuân với mật số 107 cfu/ml, 1 nghiệm thức xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb, 1 nghiệm thức đối chứng (phun nước).
Cải xanh thực hiện thí nghiệm: Giống cải bẹ xanh mỡ Trang Nông. Thí nghiệm được thực hiện tại xã Long Khê, huyện Cần Đước, tinh Long An.
- Quy mô thí nghiệm: Mỗi 6 thí nghiệm: 16 m7; Tổng diện tích thí nghiệm:
16 m?x 4x 4E 256 m7
- Chuẩn bị đất: Cày bừa, xới xáo kỹ đất trồng, phơi ải đất 5-7 ngày. Dọn sạch cỏ đại và các xác thực vật từ vụ trước; làm đất kỹ, tơi nhỏ, lên luống cao 20 — 25 cm, mặt luéng rong 1,6 m, dai 10 m, san déu mat phang luéng.
- Chuẩn bi cây con: Hat cải xanh được khử trùng bề mặt, sau đó được làm khô và gieo vào dat. Tiến hành trồng cây cải xanh 16 ngày tuổi (3-4 lá thật) vào luéng
với khoảng cách cây x cây 10 cm, hàng x hang 15 cm.
Chăm sóc cây: Tưới nước ngày 2 lần vào buổi sáng sớm và chiều mát. Bon phân khi cây có 2 lá thật (8 — 9 NSG) tiến hành tưới phân hữu cơ, 7-10 ngày tưới 1 lần. Phòng trừ sâu sử dụng thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh.
- Chuẩn bị xạ khuẩn: Các dòng xạ khuan được nuôi nhân mật số trong đĩa pétri chứa môi trường Gause I. Sau 7 ngày, tiến hành bơm 5 ml nước cất đã được thanh trùng vào đĩa, dùng lam (đã thanh trùng) thu sinh khối, và lọc qua vải lược đã thanh trùng thu được sinh khối xạ khuẩn. Tiến hành pha loãng điều chỉnh mật số 107 cfu/ml.
Thời điểm xử ly: 1 lần, khi cải xanh bắt đầu xuất hiện triệu chứng bệnh như héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết rạp. Nồng độ xạ khuẩn 107 CFU/ml (liều lượng 520 ml xạ khuẩn), mancozeb 4,167 mg/ml (liều lượng 2,2g/520 ml nước) mỗi nghiệm thức.
- Phương pháp điều tra:
+ Theo dõi tỉ lệ bệnh: Mỗi ô thí nghiệm điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm theo dõi 30 cây.
+ Theo dõi các chỉ tiêu về sinh trưởng: Mỗi ô thí nghiệm điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm theo dõi 3 cây.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết rap 6 các thời điểm 3, 7 va 10 ngày sau khi phun xử lý và tinh theo công thức:
- Ti lệ bệnh tinh theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tông số cây điều tra.
- Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức Henderson - Tilton:
E(%) = {1-[(Ta x Cb)/(Tb x Ca)]} x 100