2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 05 đến tháng 11 năm 2022, tại Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh và xã Long Khê, huyện Cần Đước, tỉnh Long An.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá tính gây bệnh của nam Ä. solani trên một số loại cải trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng đối kháng với nam R. solani của một số dòng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh với nam R. solani của xạ khuẩn trong điều
kiện nhà lưới.
; - Đánh giá kha năng trừ bệnh với nắm R. solani của xa khuẩn ở điều kiện ngoài
đông.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Nguồn nắm R. solani
Thu thập các mẫu bệnh có triệu chứng điển hình do nắm R. solani gây hại trên các loại cây trồng họ thập tự tại huyện Cần Đước, Cần Giuộc, tỉnh Long An. Các mẫu được mang về phòng thí nghiệm và phân lập tác nhân theo phương pháp của Burgess và ctv, (2009). Các mẫu được bảo quản theo phương pháp quản lý thực vật của Shivas và Beasley, (2005). Mẫu bệnh được mã hóa theo cây ký chủ và địa điểm thu mẫu (Bảng 2.1).
Bảng 2. 1 Danh sách mau nam bệnh phân lập từ các mẫu bệnh thu thập
Cây Vị trí bị . l :
STT : Địa điêm thu mầu Mã hóa mau bệnh trông bệnh
1 Cảixanh Cô rễ Cần Đước, Long An CX-CD 2 — Cải ngọt Cô rễ Cần Giuộc, Long An CN-CG 3 Cải thìa Cô rễ Cần Giuộc, Long An CT-CG
Phương pháp phân lập: Các mẫu bệnh có triệu chứng bệnh điền hình được quan sát và chon can thận, sau đó rửa dưới vòi nước dé loại bỏ các tạp chất và bụi ban. Dùng dao đã khử trùng bằng đèn cồn cắt mẫu bệnh thành từng miếng nhỏ (1 - 2 mm) tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Mẫu bệnh được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trong vòng 30 giây, rửa qua bang nước cất vô trùng 3 lần và sau đó thấm khô mẫu bệnh bằng giấy thấm vô trùng. Dùng kẹp đã khử trùng cấy các mẫu bệnh vào môi trường WA. Các đĩa được dé ở nhiệt độ 27 + 2°C và quan sát mỗi ngày. Khi tản nam phát triển (1 - 2 cm) trên môi trường WA quan sát sợi nam của tản nam có đặc điểm hình thái đặc trưng của nắm bệnh tiến hành tách và làm thuần nắm bệnh trên môi trường PDA.
Định danh loài nam R. solani: dựa vào các đặc điểm về hình thái như màu sắc, đặc điểm tan nam, đặc điểm sợi nam, hình dạng và màu sắc hạch nam dựa theo khóa
phân loại của Ogoshi (1975); Sneh (1991); Zheng (2011).
- Phương pháp định danh nam R. solani theo màu sắc, đặc điểm phát triển tản nam, hạch nam: tat cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường MEA trong điều kiện 12 giờ sáng - 12 giờ tối, sau 7 ngày nuôi cấy ghi nhận các đặc điểm về
tan nam và hạch nam.
- Phương pháp định danh nam R. solani theo đặc điểm sợi nam: Tat cả các MPL nuôi cấy trên môi trường MEA trong điều kiện 12 giờ sáng - 12 giờ tối, sau 3 ngày nuôi cay tiến hành làm tiêu ban dé quan sát đặc điểm sợi nam dưới kính hiển vi có độ phóng
đại 40X.
2.3.2 Các vật liệu nghiên cứu khác
- Nguồn xạ khuẩn: 5 dòng xạ khuẩn được cung cấp bởi Phòng Sinh học ứng dụng thực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lam Thành phó Hồ
Chí Minh (Bảng 2.2).
- Trang thiết bị: Tủ cấy khử trùng, máy hấp khử trùng bằng hơi nước nóng (121°C trong 20 phút), tủ sấy khử trùng, kính hién vi quang học Olympus CX31, cân điện tử, bếp điện, lò viba, đĩa pétri (loại thủy tinh 90 x 15 mm), cốc thủy tinh (250 mL, 500 mL).
- Môi trường PDA (20 gram dextrose, 20 gram agar và 250 gram khoai tây, nước
cất vừa đủ 1000 ml); Môi trường MEA (20 gram malt extract (mạch nha), 20 gram agar,
nước cất vừa đủ 1000 ml); Môi trường WA (nước cất 1000ml, 20 gram agar); Môi trường
Gause I (20 gram tinh bột; 0,5 gram MgSOx.7H›O; 0,5 gram K;HPOa; 1 gram KNOs; 0,5
gram NaCl; 0,01 gram FeSO..7H20; 20 gram agar, nước cat đủ 1000 ml).
Bang 2. 2 Đặc điểm của 5 dòng xạ khuẩn thí nghiệm
STT Ký hiệu Đặc điểm hình thái Hình ảnh
Khuẩn lạc màu trang, tron, dang 1 PB0I phóng xạ. Khuân ty cơ chất có
mau cam và nhạt dân vê phía ria.
Khuân lạc có mau trang xám.
2 BT06 Khuẩn ty cơ chất có màu nâu
vàng.
3 BT08 Khuân lạc có màu trăng xám.
Khuan ty cơ chat có màu nâu vàng.
Khuẩn lạc mau trắng, tròn, dạng 4 BTII phóng xạ. Khuẩn ty cơ chất có
màu trăng ngà.
Khuẩn lạc màu trắng xám và có 5 BT13 hinh dang phong xa. Khuan ty co
chat có mau tim hoặc trang.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Đánh giá mức độ gây bệnh của các MPL nắm #. solani trên một số loại cải trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm tiến hành đánh giá trên 3 loại cải xanh, cải ngọt và cải thìa được thực hiện trong đĩa pétri (90 x 15 mm) theo phương pháp của Keijer va ctv (1997). Ba mẫu
phân lập (MPL) R. solani đại điện cho 2 nhóm nam (nhóm có hạch và nhóm không hạch) được sử dụng đề đánh giá. Môi trường đề thực hiện thí nghiệm là WA, 12 hạt giống của mỗi loại rau được ủ nứt mam và đặt trên một đường thang với khoảng cách bằng nhau trên bề mặt thạch. Hai khoanh tản nắm (đường kính 4 mm) được đặt giữa các hạt giống, khoanh môi trường WA được sử dụng đối chứng. Dùng giấy bạc bọc một nửa đĩa pétri dé ngăn ánh sáng chiếu vào rễ và đặt nghiêng một góc 60°. Các đĩa pétri được dé trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ 28 + 2°C, 12 giờ sáng, 12 giờ tối.
Theo doi hàng ngày ghi nhận thời gian xuất hiện vết bệnh (ngày), tỉ lệ bệnh (%) được đánh giá 1 lần tại thời điểm 5 ngày sau chủng bệnh theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây theo dõi.
Cấp bệnh (chỉ số bệnh) là đại lượng đặc trưng cho mức độ bị hại của cây trồng được chia thành 5 cấp theo Carling và ctv, (1999): Cap 0: không có triệu chứng bệnh - không gây bệnh; Cấp 1: Trụ hạ diệp hơi mat màu - gây bệnh nhẹ; Cấp 2: Trụ hạ điệp mat mau và các vết bệnh nhỏ (đường kính < Imm) trên thân, trụ hạ diệp, lá hoặc rễ - gây bệnh nhẹ; Cấp 3: Trụ hạ diệp mất mau và các vết bệnh lớn (đường kính > Imm) trên thân, trụ hạ diệp, lá hoặc rễ - gây bệnh nặng; Cấp 4: Cây con chết - gây bệnh nặng.
2.4.2 Đánh giá khả năng đối kháng R. solani của một số dòng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố gồm 6 nghiệm thức, tương ứng với 5 đòng xạ khuẩn và 1 đối chứng (nam R. solani được nuôi trong dia petri chứa môi trường PDA không xa khuẩn), mỗi nghiệm thức 03 dia petri, 3 lần lặp lại.
Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn và nắm: xạ khuẩn và nam được nuôi cay trên môi trường PDA 7 ngày sau đó tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cấy kép. Xạ khuẩn được cấy thành hai đường thang song song bằng que cấy vòng trên đĩa pétri chứa 10 ml môi trường
PDA. Sử dụng dụng cụ đục lỗ đường kính 4 mm lấy khoanh nắm chuyên vào giữa đĩa pétri đã cay xạ khuẩn. Đĩa pétri được đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng và đánh giá khả năng đối kháng của các dòng xạ khuẩn với nam R. solani bang cách đo đường kính tản nam và tính hiệu suất đối kháng ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau thí nghiệm.
Hiệu suất đối kháng (HSDK) được tính toán theo Palanayandi va ctv, (2011):
Hiệu suất đối kháng (%)=((G1-G2)/G1) x 100%. Trong đó: G1 là đường kính vùng tản nam ở nghiệm thức đối chứng; G2 là đường kính vùng tản nam ở nghiệm thức có xạ khuẩn.
Mức độ đối kháng được đánh giá theo Lee và Hwang (2002) dựa vao hiệu suất đối kháng như sau: Hiệu quả rất mạnh: 76 - 100%; Hiệu quả mạnh: 51 - 75%; Hiệu quả
trung bình: 26 - 50%; Hiệu quả kém: 1 - 25%; Không hiệu quả: 0%.
2.4.3 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh do nam RK. solani của xạ khuẩn trong điều kiện nhà lưới
2.4.3.1 Đánh giá khả năng phòng bệnh do nam #. solani của xạ khuẩn trong điều
kiện nhà lưới
Phương pháp bố trí thí nghiệm: Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nam R. solani trong điều kiện phòng thí nghiệm (2.4.2), chọn 01 dòng xạ khuẩn có kha năng đối kháng cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng phòng bệnh trong điều kiện nhà lưới. Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 4 nghiệm thức: (1) hạt không xử lý xạ khuẩn gieo đất không nhiễm nắm bệnh (đối chứng âm), (2) hạt không xử lý xạ khuẩn gieo đất nhiễm nắm bệnh (đối chứng dương), (3) hạt xử lý xạ khuẩn gieo đất nhiễm nắm bệnh, (4) hạt xử lý thuốc trừ
bệnh Dithane M45 WP (80% Mancozeb).
Mỗi nghiệm thức thực hiện 2 khay, mỗi khay 50 hạt cải xanh, 4 lần lặp lại. Thi nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập.
Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được tiến hành trong khay hình chữ nhật (68 x 42 x 15 cm) chứa 5 kg giá thé hỗn hợp đất - tro trau - xơ dita được trộn theo tỉ lệ 1 - 1 - 1, khử trùng bằng hơi nước nóng 121°C trong 20 phút. Ching 500 hạch nam ở mỗi khay nhựa (theo từng nghiệm
thức) ở độ sâu 1 - 5 cm. Các khay được bao phủ bằng màng nhựa và ủ trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng đề thúc đây sự phát triển của mầm bệnh.
Chuẩn bị xạ khuẩn: xạ khuẩn được nuôi nhân trong đĩa pétri chứa môi trường Gause I. Sau 7 ngày, tiến hành bơm 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa, dùng lam (đã thanh trùng) thu sinh khối, và lọc qua vải lược đã thanh trùng thu được sinh khối xạ khuẩn. Pha loãng điều chỉnh mật số 107 cfu/ml.
Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với Ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo ngâm trong dung dich Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút. Sau đó
hạt giông được rửa lại 3 lân với nước cât vô trùng.
Nghiệm thức hạt không xử lý: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt, sau đó được làm khô, gieo với độ sâu 1 em vào khay đất theo từng nghiệm thức đối chứng âm, đối
chứng dương.
Nghiệm thức hạt xử lý xạ khuẩn: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt ngâm 30 phút trong huyền phù xạ khuẩn mật số 10” CFU/ml, sau đó được làm ráo và gieo với độ sâu 1 cm vào đất đã chủng nam.
Nghiệm thức hạt xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt ngâm 30 phút trong mancozeb với nồng độ 4,167 mg/ml và sau đó được làm ráo gieo với độ sâu 1 cm vào đất đã chủng nam.
Chỉ tiêu theo dõi
- Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cô rễ, chết rạp ở thời điểm 10 ngày sau khi gieo hat. Tỉ lệ bệnh tính theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%.
Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Khả năng phòng bệnh tính theo công thức (Susilowati và ctv, 2011): Kha năng
phòng bệnh (%) = [(C* - C')/(C - C*)] x 100; Trong đó: C* là số cây khỏe mạnh trong nghiệm thức; C* là số cây khỏe mạnh trong đối chứng nhiễm bệnh; C- là số cây khỏe mạnh trong đối chứng không bị nhiễm bệnh.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng: Chiều cao cây (cm) đo từ bề mặt giá thể đến chóp lá cao nhất của cây; Chiều dài rễ (cm) đo từ cô rễ đến đỉnh sinh trưởng của chop rễ dai nhất.
- Trọng lượng tươi và trọng lượng khô: Trọng lượng tươi (mg/cây): xác định bằng cách cân khối lượng cây tươi. Trọng lượng khô (mg/cây): xác định bằng cách cân sau khi say ở nhiệt độ 50°C cho đến khi khối lượng không đồi.
2.4.3.2 Đánh giá khả năng trừ bệnh do nam R. solani của xạ khuẩn trong điều
kiện nhà lưới
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 3 nghiệm thức (1 nghiệm thức xử lý xạ khuẩn, 1 nghiệm thức xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb, 1 đối chứng phun nước), mỗi nghiệm thức thực hiện 2 khay, mỗi khay trồng 15 cây cải xanh, 4 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập.
Phương pháp thực hiện:
Mỗi khay chứa 5 kg giá thé đã được hap khử trùng, tién hành chủng 500 hạch nam R. solani ở mỗi khay nhựa ở độ sâu 1 - 5 cm. Các khay được bao phủ bang màng nhựa và ủ trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng để thúc đây sự phát triển của mầm bệnh. Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với Ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo ngâm trong dung dich Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút. Sau đó hạt giống được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng, sau đó được làm khô, gieo với độ sâu 1 cm vào bau đất đã khử trùng. Tiến hành trồng cây cải xanh 15 - 20 ngày tuổi (3 - 4 lá thật) vào khay nhựa đã được chủng nam R. solani.
Thời điểm xử ly: 1 lần, khi cải xanh đang có bệnh lở cô rễ bắt đầu gây hại với ti lệ bệnh khoảng 5%. Nong độ xạ khuẩn 107 CFU/ml, mancozeb 4,167 mg/ml (liều lượng với xạ khuẩn 18 ml, mancozeb 75 mg/18 ml nước mỗi nghiệm thức).
Chỉ tiêu theo dõi
Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cô rễ, chết Tạp ở các thời điểm 3, 7 và 14 ngày sau khi phun xử lý và tính theo công thức:
- Ti lệ bệnh tính theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức Henderson - Tilton:
E(%) = {1I-[(Ta x Cb)/(Tb x Ca)]} x 100
Trong đó: E: Hiệu lực phòng trừ; Ta: Tỉ lệ bệnh mới phát sinh ở công thức xử lý
thuốc tại thời điểm sau xử lý; Tb: Tỉ lệ bệnh công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý; Ca: Tỉ lệ bệnh mới phát sinh ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý; Cb:
Ti lệ bệnh ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lý.
- Diện tích bên dưới đường cong tích lũy bệnh AUDPC (Area Under Disease Progressive Curve) được tính theo công thức (Cooke, 2006):
AUDFPC-Xj-¡[Œff + Yt +1)/2]z (Tƒ + 1 — Tj)
Trong đó: n tổng số ngày theo đối, i ngày theo déi thứ ¡, Y; tỉ lệ bệnh ngày thứ ¡, Y¡.¡ Tỉ lệ bệnh ngày thứ ¡+1, T;+1 — T; thời gian giữa 2 lần theo dõi.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng: Chiều cao cây (cm); Số lá/cây; Chiều dai lá (cm);
Chiều rộng lá (cm); Chiều dài rễ (cm).
- Chỉ tiêu về năng suất: Trọng lượng tươi (g/cây), trọng lượng 6 thí nghiệm (g).
2.4.4 Đánh giá khả năng trừ bệnh lở cỗ rễ của xạ khuẩn ngoài đồng
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, trong đó 1 nghiệm thức xử lý xạ khuẩn với mật số 107 cfu/ml, 1 nghiệm thức xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb, 1 nghiệm thức đối chứng (phun nước).
- Quy mô thí nghiệm: Mỗi 6 thí nghiệm: 16 m2; Tổng diện tích thí nghiệm: 16 m?
x3x4= 192 mi.
- Chuẩn bị đất: Cày bừa, xới xáo kỹ đất trồng, phơi ải đất 5 - 7 ngày. Dọn sạch cỏ đại và các xác thực vật từ vụ trước, làm đất kỹ, tơi nhỏ, lên luéng cao 20 - 25 cm, mat luéng rong 1,6 m, dai 10 m, san déu mat phang luéng.
- Chuan bị cây con: Hat cai xanh được khử trùng bề mặt, sau đó được làm khô và gieo vào đất. Tiến hành trồng cây cải xanh 16 ngày tudi (3 - 4 lá thật) vào luống với khoảng cách cây x cây 10 cm, hang x hàng 15 cm. Chăm sóc cây: Tưới nước ngày 2 lần vào budi sáng sớm và chiều mát. Bon phân khi cây có 2 lá thật (8 - 9 NSG) tiễn hành tưới
phân hữu cơ, 7 - 10 ngày tưới 1 lần. Phòng trừ sâu sử dụng thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi
sinh.
- Chuẩn bị xạ khuẩn: Các dòng xạ khuẩn được nuôi nhân mật số trong đĩa pétri chứa môi trường Gause I. Sau 7 ngày, tiễn hành bom 5 ml nước cất đã được thanh trùng vào đĩa, dùng lam (đã thanh trùng) thu sinh khối, và lọc qua vải lược đã thanh trùng thu được sinh khối xạ khuẩn. Tiến hành pha loãng điều chỉnh mật số 107 cfu/ml.
- Thời điểm xử lý: 1 lần, khi cải xanh đang có bệnh lở cổ rễ bắt đầu gây hại với tỉ lệ bệnh khoảng 5%. Nong độ xạ khuẩn 10’ CFU/ml (liều lượng 520 ml xạ khuẩn), mancozeb 4,167 mg/ml (liều lượng 2,2 g/520 ml nước) mỗi nghiệm thức.
- Phương pháp điều tra:
+ Theo dõi tỉ lệ bệnh: Mỗi ô thí nghiệm điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm theo dõi 30 cây.
+ Theo dõi các chỉ tiêu về sinh trưởng: Mỗi 6 thí nghiệm điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm theo dõi 3 cây.
- Chỉ tiêu theo dõi: Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết rạp ở các thời điểm 3, 7 và 10 ngày sau khi phun xử lý và tính theo công thức:
TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức Henderson - Tilton:
E(%) = {1-[(Ta x Cb)/(Tb x Ca)]} x 100
Trong đó: E: Hiệu lực phòng trừ; Ta: Tỉ lệ bệnh mới phat sinh ở công thức xử lý
thuốc tại thời điểm sau xử lý; Tb: Tỉ lệ bệnh công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý; Ca: Ti lệ bệnh mới phát sinh ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử ly; Cb:
Ti lệ bệnh ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lý.
- Diện tích bên dưới đường cong tích lũy bệnh AUDPC (Area Under Disease Progressive Curve) được tính theo công thức (Cooke, 2006):
AUDPC=Y”_,[(Vi + Yi + 1)/2]x (TJ + 1— Tj)