3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Kỹ thuật Thực phẩm và Vi sinh Thực phẩm, khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện khóa luận từ tháng 6/2022 đến tháng 10/2022.
3.2. Nguyên liệu 3.2.1. Cay móc mèo
Cây móc mẻo sử dụng trong nghiên cứu được thu hái tại tỉnh Quảng Nam. Sau
khi thu hái, phần thân móc mèo được đem di rửa sạch, chặt nhỏ và phơi khô (Hình 3.1).
Nguyên liệu tiếp tục được sấy khô ở nhiệt độ 60°C bằng tủ say khí nóng đến khi đạt độ am 10 + 2%. Nguyên liệu khô được xay nhỏ dang thành bột va ray qua sàng có đường kính lỗ 0,125-0,25 mm. Bột có độ âm 5 — 6% được chứa trong bao nhựa hàn kín, chắn sáng và bảo quản tại tủ đông dé chuẩn bị cho quá trình trích ly, cô đặc cao.
Hình 3.1 Cây móc mèo sấy khô (A); Bột cây móc mèo (B).
3.2.2 Nem chua
Nghiên cứu này sử dụng nem bán thành phẩm (nem đã phối trộn nguyên liệu và chưa lên men) của Hộ kinh doanh Hưng Phát dé tiễn hành thí nghiệm.
Hình 3.2 Nem bán thành phẩm 3.3. Hóa chất
Ethanol > 99,5% (Việt Nam); Methanol > 99,5%, NazCOa > 99,8%, CaCl >
96,0%, Alginate và HPMC (Xilong, Trung Quốc); Follin- Ciocalteu’s Phenol (Sigma-
USA); 1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl DPPH (Nhat Bản); Galic acid (Sigma-USA);
Trisodium citrate > 99,0% (Trung Quéc); MRS agar, PCA agar va DRBC agar (Himedia, An D6); NaCl > 99,5% (Trung Quéc).
3.4. Dung cu
Micropipet, pipet, ống nghiệm thủy tinh, ống dong, bình định mức curvet, kim tiêm, bình tam giác, cốc thủy tinh, dia petri, bình shcott, đũa thủy tinh, giay loc Newstar, ống ly tâm, đầu tuýp.
3.5. Quy trình chuẩn bị hạt vi bao
3.5.1. Quy trình trích ly polyphenol
Polyphenol từ thân cây móc mèo được thu nhận bằng cách tham chiếu đề tài nghiên cứu của Nguyễn Thái Như (2018). Đầu tiên, thân cây móc mẻo sau khi thu hái được rửa sạch với nước, dé ráo, cắt thành từng đoạn nhỏ và sấy khô ở 60°C trong tủ say không khí nóng (Trung Quốc) cho đến khi đạt độ âm dưới 13%. Nguyên liệu tiếp tục được xay nhỏ va ray qua sàng có kích cỡ lỗ 0,1 mm tạo bột móc mèo. Tiếp đó, 30 g bột được trích ly lần 1 bang cách ngâm với 300 mL ethanol 70% tại điều kiện nhiệt độ phòng
30 + 2°C, tránh ánh sáng. Sau 48 giờ, hỗn hợp được lọc qua vải. Dịch trích được bảo quan ở 4 + 1°C trong ngăn mát tủ lạnh. Phan bã tiếp tục được trích tương tự lần 1, tuy
nhiên hàm lượng ethanol 70% cần sử dụng là 150 mL. Tiếp theo, dịch chiết thu được sau 2 lần trích được phối trộn và ly tâm với 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch trong thu
được sau ly tâm tiép tục được cô quay thu nhận cao móc mẻo.
Hình 3.3 Dịch cao chiết móc mèo 3.5.2. Quy trình chuẩn bị hạt vi bao
Quy trình vi bao được thực hiện theo đề tài nghiên cứu của Chế Mỹ Linh (2022), gồm các bước:
Chuẩn bị dịch vi bao: Cân chính xác 0,3 g dich chiết cô đặc (hàm lượng polyphenol là 20,95 + 0,73 mgGAE/100gVCK) và phối với 10 mL nước cất thu được dung dich A có nồng độ cao chiết là 3%.
Chuẩn bị dung dịch màng bao: Đầu tiên, alginate và HPMC được trộn đều theo tỷ lệ 80 : 20 (g/g), tiếp theo hỗn hợp được hòa tan với nước đề thu dung dịch B có nồng độ 2,5 %. Hỗn hợp được đề ồn định trong 2 giờ tại nhiệt độ 30 + 1°C.
Vi bao: Trong một cốc thủy tinh 250 mL, dung dịch A và B được trộn đều theo dich CaCl 3%. Hỗn hợp được đồng hóa bằng máy đồng hóa (IKA, Đức) với tốc độ 8000 vòng/phút trong 3 phút, sau đó dé yên trong 15 phút. Dich vi bao cho vào ống xi lanh 10 mL và bơm nhỏ giọt bằng tay vào cốc chứa CaCl2 3% và ngâm trong 30 phút tại nhiệt độ phòng, sau đó hạt được vớt ra rửa với nước cất và dé ráo. Hạt được sử dụng trong ngày cho chế biến nem.
Tạo dịch Tạo dịch
Os
Phối tron
Ngâm trong dung dịch CaCh
J
Lọc
|
Hình 3.4 Quy trình vi bao dịch chiết polyphenol từ cây móc mèo.
3.6 Quy trình chuẩn bị nem chua
Nguyên liệu chuẩn bị nem chua gồm thịt nạc heo, da heo, đường, muối Iot, tiêu, tỏi, bột ngọt, ớt, Tari K7, Lactobacillus spp (10° CFU/g). Các nguyên liệu được phối trộn theo công thức của hộ kinh doanh nem Hưng Phát và chế biến theo quy trình trong
Hình 3.6.
Da heo
Làm sạch ô<<. Xử lý sơ bộ
Ỷ Ỷ Ỷ
Sơ chế Lột vỏ Luộc chín
Vv Vv Ỳ
Xay Băm nhuyễn Lóc mỡ
C vi Quết TT. Cắt sợiỶ Ỷ
Định hình Xay nhỏ
{ |
Làm sạch Ƒ*|_— Đóng gói N
U chua,
3.7 Bồ trí thí nghiệm
3.7.1 Đánh giá ảnh hướng của tỷ lệ bỗ sung hat vi bao cao móc mèo đến quá trình
lên men nem chua
Đầu tiên, thịt heo đã xay nhuyễn được trộn đều với da heo, hành và gia vị. Tiếp theo hỗn hợp được trộn đều cùng với hạt vi bao móc mèo ở các tỷ lệ khác nhau gồm 3, 5, 7 và 9% (g/g). Sau đó, nem được chia thành các phần có khối lượng 35 g và định hình thành cỏc thanh hỡnh trụ cú kớch thước (dai 3cm, ỉ lem). Nem được gúi bằng một lớp plastic bên trong - một lớp lá chuối và một lớp plastic kín bên ngoài. Sau đó, nem được buộc chặt bằng dây nilong và lên men tại nhiệt độ 28-32°C. Quá trình lên men kết thúc khi sản phẩm đạt pH là 4,53 + 0,01. Trong quá trình lên men, cách 2 ngày/lần mẫu được tiền hành phân tích các chỉ tiêu gồm pH, acid tông (%); cách 6 ngay/lan mẫu được phân tích mật độ vi khuẩn lactic. Khi quá trình lên men hoàn tất, các mẫu được đo hàm lượng polyphenol tông, DPPH và đánh giá cảm quan.
3.7.2 Đánh giá ảnh hưởng của hạt vi bao móc mèo đến chất lượng của nem chua
trong quá trình bảo quản
Đầu tiên, thịt heo đã xay nhuyễn được trộn đều với da heo, hành và gia vị. Tiếp theo, hỗn hợp được trộn đều cùng với hạt vi bao móc mèo với tỷ lệ được lựa chọn ở thí nghiệm trước. Sau đó, nem được chia thành các phần có khối lượng 35 g và định hình thành cỏc thanh hỡnh trụ cú kớch thước (dài 3em, ỉ 1em). Nem được gúi bằng một lớp plastic bên trong — một lớp lá chuối và một lớp plastic kín bên ngoài. Sau đó, nem được buộc chặt bằng dây nilong và lên men tại nhiệt độ 28-32°C. Mẫu đối chứng là nem không
bô sung hạt vi bao.
Sau lên men, nem được chia thành 2 mẻ với điêu kiện bảo quản khác nhau:
Mẻ 1: nem được bao quan ở nhiệt độ phòng (30 + 2°C) trong 15 ngày. Trong quá
trình bảo quản, cách 3 ngày/lần mẫu được tiến hành phân tích các chỉ tiêu gồm mật độ vi sinh vật hiếu khí, men mốc, pH, acid tổng (%), đo hàm lượng polyphenol tổng và
DPPH.
Mẻ 2: nem được bảo quản ở tủ lạnh với nhiệt độ (4 + 1°C) trong 45 ngày. Trong
quá trình bao quản, cách 9 ngay/lan mẫu được tiến hành phân tích các chỉ tiêu gồm mật độ vi sinh vật hiếu khí, men mốc, pH, acid tổng (%), do hàm lượng polyphenol tổng và
DPPH.
3.8 Các phương pháp phân tích
3.8.1 Trích ly hợp chất sinh học
Dé phân tích hàm lượng polyphenol tổng, cần tạo dịch trích chứa polyphenol bằng cách phá và kết tủa protein từ hạt vi bao và nem đã tách hạt.
Chuẩn bị dịch trích polyphenol: trường hợp nem chua (Lara và ctv, 2011)
Cân 0.5g nem đã được xay nhuyễn trộn và trộn đều với 10mL methanol 80%.
Lắc đều mẫu trong 30 giây và ủ hỗn hợp 30 phút nhiệt độ 30 + 2°C. Tiếp theo hỗn hợp
được ly tâm lạnh (4°C) trong 5 phút ở 3000 vòng/phút.
Chuẩn bị dịch trích polyphenol: trường hợp hat vi bao
Cân 1 g hạt vi bao ngâm vào dung dich sodium citrate 5% theo tỷ lệ = 1:5 (g:
ứ), mẫu được ngõm trong 12 giờ, rồi tiếp tục lắc trộn bằng mỏy Vortex đến khi hạt vi bao hòa tan hoàn toan. Tiếp theo, 0,5 mL dich được trộn đều với 5 mL methanol 80%
và ủ hỗn hợp 30 phút. Tiếp theo hỗn hợp được ly tâm lạnh ở 4°C trong 5 phút ở tốc độ
3000 (vòng/phút) thu được dịch trích (de Souza và ctv, 2018; Lara va ctv, 2011)
3.8.2 Phân tích polyphenol tổng
Xác định tổng hàm lượng polyphenol bằng thuốc thử Folin-ciocalteau (Singleton
và ctv, 1999). Đây là phương pháp đo màu dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa các hợp
chất polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau (hỗn hợp của phosphomolybdat và phosphotungstat). Trong môi trường kiềm, thuốc thử sẽ oxy hóa các hợp chat polyphenol và sinh ra các acid heteroply màu xanh da trời có cực đại hấp thu ở 760 nm. Phương pháp này sử dung acid gallic làm chất chuẩn và tổng hàm lượng polyphenol sẽ được tinh bằng cách quy về lượng tương đương với chất chuẩn acid gallic (GA). Kết quả được
Hoá chất
Dung dich acid gallic gốc 40 mg/L được pha bang cách cân chính xác 0,01 g acid gallic cho vào cóc thuỷ tinh, có chắn sáng. Axit gallic được hoa tan với 10 mL nước cất và lắc đều. Sau đó, dung địch axit gallic được chuyền định lượng vào bình định mức đến vạch (25 mL) bằng nước cất và lắc đều. Bình định mức được bọc giấy nhôm để chắn
sáng.
Dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteau (pha loãng 10 lần) được chuẩn bị bằng cách hút Iml thuốc thử cho vào bình định mức đến vạch (10 mL) bằng nước cất và lắc đều, có chắn sáng.
Dung dich Na2CO3 20 % được chuẩn bị bằng cách cân 50 g Na2CO3 vào cốc thuỷ tinh (500 mL). Na2CO3 được hoà tan với 100 mL nước cat và khuấy từ bằng may khuấy cho đến khi tan hoàn toản. Tiếp theo, dung dịch Na2CO3 được chuyên định lượng vào bình định mức đến vạch chuẩn (250 mL) bằng nước cat và lắc đều. Dung dịch NazCOa 20 % được chuẩn bị bé sung hàng ngày cho toàn bộ thí nghiệm.
Xây dựng đường chuẩn
Từ dung dich acid gallic gốc, các dung dịch chuẩn acid gallic có nồng độ từ 3,12, 6,24, 12,52, 25, 50 mg/L được chuẩn bị bang cách hút lần lượt thể tích dung dịch axit gallic gốc theo bảng 3.6.1 cho vào bình định mức đến vạch (10 mL) bang nước cat.
Bảng 3.1: Chuan bị đường chuẩn axit gallic.
Nong độ mẫu chuẩn (mg/L) Thể tích mẫu chuẩn (nL)
3,12 78 6,24 156 12,52 313 25 625 50 1250
Quy trình tiến hành như sau: cho lần lượt 1 mL nước cat vào từng ống nghiệm, tiếp tục thêm | mL dung dich acid gallic ở các nồng độ đã được chuẩn bị theo bảng 3.1,
ống nghiệm. Mẫu được lắc đều và đề yên trong 8 phút. Sau đó, 1,5 mL dung dịch NazCO3 20% và 1 mL nước cất được thêm vào từng ống nghiệm rồi lắc đều. Mẫu được ủ trong tối tại nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, mẫu được đo độ hấp thụ tại bước sóng 760 nm. Mẫu trắng thuốc thử cũng được tiến hành như mẫu chuân nhưng thay 1 mL axit gallic bang 1 mL nước cất. Sau khi có kết quả so màu, đường chuẩn axit gallic tuyến tính được dựng dựa vào mật độ quang của dung dich chuẩn axit gallic (phụ lục 3.1) sau khi đã trừ đi mật độ quang của mẫu trắng thuốc thử.
Hàm lượng polyphenol được tính theo công thức:
(y—b)x Vx Dfx 100
axmx1000 TPC =
Trong đó: TPC: hàm lượng polyphenol (mg GAE/g), y: giá tri OD của mẫu phân tích, a và b: hệ số trong phương trình đường chuẩn gallic acid (10-70 pg/mL), V: thể tích dich trích ly, m: khối lượng của mau, Df: Hệ số pha loãng mau, 100/1000: hệ số chuyền đổi từ ug/g sang mg/100g.
3.8.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa (DPPH)
Xác định hoạt độ kháng oxy hoá của các chống oxy hoá bằng phản ứng với DPPH gốc bền theo phương pháp của Deladino L và ctv (2008). Các chất kháng oxy hoá có khả năng trung hoà gốc DPPH tự do theo cơ chế electron tự do của gốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hoá và một nguyên tử Hydro dé tạo thành DPPH-H khử. Dung dịch phản ứng sẽ chuyền từ màu đỏ tía sang màu vàng hoặc màu vàng cam, làm giảm độ hấp thụ quang của dung dich ở bước sóng 517 nm. Hoạt độ chống oxy hoa của mau được biéu thị bằng mg AAE/g mau.
Hoá chất
Dung dịch chất chuẩn axit ascorbic: Cân chính xác 0,001 g axit ascorbic vào cốc thuỷ tinh có chắn sáng. Sau đó, axIt ascorbic được chuyền định lượng vào bình định mức đến vạch (10mL) bang nước cat, lắc đều và được bọc giấy nhôm dé chắn sáng. Chất chuẩn axit ascorbic được pha hàng ngày dé dùng cho thí nghiệm.
Dung dịch thuốc thử DPPH: Cân chính xác 0,0039 g DPPH vào cốc thuỷ tinh có chan sáng. Tiếp theo, khoảng 50 mL ethanol 99,5% được thêm vào cốc thủy tinh và mẫu được khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi DPPH tan hoàn toàn. Toàn bộ dung dịch DPPH được chuyển từ cốc thuỷ tinh sang bình định mức và định mức đến vạch (100 mL) bằng ethanol 99,5%; lắc đều; chắn sáng và tiếp tục thí nghiệm. Dung dịch thuốc thử được chuẩn bị trong ngày phân tích.
Cách tiến hành
Từ dung dich axit ascorbic gốc, dãy chuẩn có nồng độ từ 10, 20, 40, 80, 100 mg/L được pha bằng cách hút lần lượt 100, 200, 400, 800, 1000 uL dung dịch axit ascorbic gốc cho vào bình định mức đến vạch chuẩn (10 mL) bang nước cất. Qui trình so mau tiền hành như sau: cho lần lượt 200 pL dung dịch chất chuan vào các ống nghiệm. Sau đó thêm 4 mL dung dịch thuốc thử DPPH 0,0039% vào mỗi ống và ủ trong bóng tối tại nhiệt độ phòng. Sau 30 phút, mẫu được đo mật độ quang tại bước sóng 517 nm. Giá trị OD được ghi nhận và tiễn hành vẽ đường thắng hiệu chuẩn đề xác định hoạt độ kháng oxy hoá của mẫu.
Tương tự, mẫu được thực hiện như dung dịch axit ascorbic chuan nhung thay bang dung dich mau.
Cong thirc tinh toan
(y—b)x Vx Df x 100
axmx 1000 DPPH =
Trong đó: y: giá tri OD của mẫu phân tích, a và b: hệ số trong phương trình đường chuẩn ascorbic acid (0 - 100 ug/mL), V: thé tich dich trich ly, Df: độ pha loãng, m: khói lượng của mẫu. 100/1000: hệ số chuyên đổi từ ug/g sang mg/100g.
3.8.4 Phương pháp đo pH
Bang máy đo pH dé bàn HORIBA PH 1100 (Nhật ban). Máy trước khi sử dụng được hiệu chuẩn bằng dung dịch đệm pH chuẩn là 4,0 và 9,0.
Do mau: Cho 10 g nem đã xay nhuyễn vào bình định mức 100ml bằng nước cat.
đầu điện cực bằng nước cất, dùng khăn giấy thấm khô điện cực. Sau đó cắm đầu điện cực vào dịch mẫu, đợi đến khi giá trị hiển thị ôn định thì ghi nhận kết quả đo. Rửa đầu điện cực bằng nước cất giữa mỗi lần thử mẫu và lap lại.
3.8.5 Hàm lượng acid tong
Cỏch tiến hành: Cho 10 ứ mẫu vào trong bỡnh định mức 100 ml, mẫu được định mức đến 100 ml bằng nước cat. Hỗn hợp được lắc đều và lọc qua giấy lọc thu dịch trích.
Cho 10 mL dịch trích và 3 giọt phenolphtalein 1% vào trong bình tam giác 100 mL. Mẫu được lắc đều và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hong bên trong 30 giây.
Công thức tính toán
Va X Vo X K XC X100 V3 xm
TA
Trong đó: TA: hàm lượng acid tổng số của mau (%), Vị: tổng thé tích dich trích, V2: thé tích NaOH 0,1N dung dé chuẩn độ mau, V3: thé tích mẫu đem chuẩn độ, m: khối lượng mẫu, K: hệ số acid lactic (0,09), C: nồng độ NaOH dung dé chuẩn độ (0,1 N).
3.8.6 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn lactic tổng số
Mật độ vi khuẩn lactic tổng số được xác định bằng phương pháp đồ đĩa được tham chiếu theo TCVN 7906:2008 (ISO 15214:1998).
Chuẩn bị môi trường MRS agar
Hoà tan 67,15 g môi trường MRS trong 1 lít nước cat, đun nóng nhẹ cho tan hoàn toàn. Phân phối môi trường vào các bình shcott có dung tích thích hợp và khử trùng trong 15 phút ở 121°C bằng nồi hap tiệt trùng (ALP, Nhật Bản).
Nếu môi trường được dùng ngay thì làm nguội từ 44°C đến 47°C trước khi sử dụng. Nếu không dùng thì bảo quản nơi tối ở nhiệt đọ 3 + 2°C không quá 3 tháng.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn
nồng độ 101. Dung dịch tiếp tục được pha loãng bằng nước muối 0,85% đến các nồng độ thích hợp. Quá trình được thực hiện gần đèn cồn.
Cách thực hiện
Sử dụng micropipet có gắn đầu tuýp vô trùng hut | ml dich vi khuẩn vào dia petri vô trùng. Rot vào mỗi đĩa chứa dịch vi khuan khoảng 15 -20 ml môi trường MRS agar ở 44 - 47°C. Tiếp theo, trộn đều dich khuan và môi trường bằng cách xoay đĩa theo chiều đồng hồ 3 lần và ngược lại. Hỗn hợp được để yên đến khi đông đặc. Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và đặt vào tủ ủ. Không xếp chồng quá 6 đĩa. Các chồng đĩa cần được tách
khỏi nhau và cách xa thành và nóc tủ.
Đếm khuẩn lạc
Sau 24 + 3 giờ ủ mẫu ở 37 + 1°C, mẫu được lấy ra khỏi tủ ủ, chọn các mẫu có số lượng khuẩn lạc dao động từ 25 — 250 khuẩn lạc hoặc 30 — 300 khuẩn lạc và ghi nhận kết quả. Mỗi mẫu phân tích được kiểm nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ được thực viện với 2 đĩa petri. Quy trình được thực hiện gần đèn cồn.
Công thức tính toán
" xế
V x(n1+0,1 x 2) xd
Trong đó: N: Mật độ vi khuẩn lactic tổng số (CFU/g), C: Tổng số khuẩn lạc đếm được, nl: số đĩa đếm được ở nồng độ thứ 1, n2: số đĩa đếm được ở nồng độ thứ 2, d: hệ số pha loãng của nồng độ thứ 1, V: thé tích dich cấy đã cấy trên mỗi đĩa (mL).
3.8.7 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật hiếu khí
Mật độ vi sinh vật hiếu khí tổng số được xác định bằng phương pháp đồ đĩa được tham chiếu theo TCVN 4884-1:2015 (ISO 4883-1:2013).
Chuẩn bị môi trường PCA
Hoà tan 23,5 g môi trường PCA trong 1 lít nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hoàn toàn. Phân phối môi trường vào các bình shcott có dung tích thích hợp và khử trùng trong 15 phút ở 121°C bằng nôi hấp tiệt trùng (ALP, Nhật Bản).