2.1 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát khả năng đôi kháng của các dòng vi khuân có ích với vi khuân Ralstonia solanacearum điêu kiện phòng thí nghiệm.
Đánh giá độc tính của các dòng vi khuân đối kháng đối với hạt cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Khao sát môi trường tối ưu dé nhân sinh khối các dòng vi khuẩn đối kháng với
vi khuân Ralstonia solanacearum.
Đánh giá kha năng đối kháng của các dòng vi khuan đối kháng mạnh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua trong phòng thí nghiệm và cây cà
chua trong nhà lưới.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05 năm 2022 đến tháng 10 năm 2022.
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật và
trại thực nghiệm, khoa Nông học, Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
15
2.3 Vật liệu thí nghiệm
Đối tượng thí nghiệm:
Các dòng vi khuẩn tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật.
Bang 2.1 Danh sách các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu
STT Kí hiệu Chi*
| CXT3 Ralstonia solanacearum 2 CC-LD 2.2 Actinobacteria 3 CCEN 1.1 Pseudomonas sp.
4 ĐHTI Enterobacteriaceae 5 DHT3 Pseudomonas sp.
6 DHT7 Pseudomonas sp.
7 ĐNHI Bacillus sp.
8 DNH3 Pseudomonas sp.
9 ĐNHS Bacillus sp.
10 ĐXTI Pseudomonas sp.
11 DXT2 Bacillus sp.
12 DXT6 Bacillus sp.
"+ định danh bằng đặc điểm sinh hóa
Dụng cụ, thiết bị máy móc:
Các trang thiệt bị gôm: cân điện tử, bêp điện, kính hiên vi, đèn côn, máy ảnh,
dụng cụ cấy, đĩa petri, que cấy, nồi hấp khử trùng, máy lắc.
Thành phần môi trường:
Môi trường LB: 1 lít peptone 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước 1000 mL, pH 7,0. Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường KBA: peptone 20 g, glycerol 10 g, KjHPO, khan 1,5 g, MgSO¿.7H;O
1,5 g, Agar 1g, nước cất 1000 mL. Trộn chung tat cả các thành phần ngoại trừ MgSO¿. Điều chỉnh pH đến 7,2. Từ từ thêm MgSO, và lắp đều. Hap khử trùng ở 121°C trong 25 phút.
Môi trường NB: peptone 5 g, NaCl 5 g, HM peptone 1,5 g, yeast extract 1,5 g, nước
cat 1000 mL.
Môi trường NBY: Nutrient-broth 8 g, yeast extract 2 g, KzZHPO,(khan) 2 g; KH PO,
0,5 g, nước cất 1000 mL.
Môi trường SPA: Sucrose 20 g; Peptone 5 g; K2HPO4 0,5 g; MgSO4.7H20 0,25 g;
agar 15 g; nước cat 1000 mL.
Môi trường WA: thành phan Agar 20 g, nước cat 1000 mL.
Môi trường YDC: CaCO; 20 g, Yeast extract 10 g, agar 20 g, nước cất 1000 mL.
17
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Bảng 2.2 Danh sách các thí nghiệm được bồ trí trong nghiên cứu
Mục Tên thí nghiệm
1 Khao sát khả nang đôi khang cua các dòng vi khuân có ích đôi với vi khuan Ralstonia solanacearum trong phòng thí nghiệm
2 — Đánh giá độc tính các dòng vi khuẩn đối kháng đối với hạt cà chua điều
kiện phòng thí nghiệm
ạ — Khảo sát điều kiện nhân sinh khối tối ưu dé nhân sinh khối các dòng vi
khuân đôi kháng mạnh với vi khuân Ralstonia solanacearum
4 Xác định môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp 1
Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối của các dòng vi khuẩn 6 Đánh giá lại khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn sau khi nhân sinh
khôi cap 1
z — Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng mạnh với
vi khuan Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua trong phòng thí nghiệm
8 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng mạnh với
vi khuân Ralstonia solanacearum trong điêu kiện nhà lưới
2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn có ích đối với vi khuẩn
Ralstonia solanacearum trong phòng thí nghiệm
Vi khuan Ralstonia solanacearum mạnh nhất từ nguồn vi khuẩn phòng thí nghiệm bộ môn được chọn đề đánh giá tính đối kháng. Tính đối kháng của các dòng vi khuân có ích được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của vi khuẩn có ích với vi khuân bệnh. Vi khuân đối kháng có khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuan bệnh. Vi khuẩn đối kháng được vi khuẩn bệnh sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.
2.4.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố tri theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi dòng vi khuẩn đối kháng là một nghiệm thức là 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại ứng với 1 đĩa petri.
Vi khuẩn Ralstonia
solanacearum
Vi khuẩn đối kháng
Nước cât
Hình 2.1 Bồ trí vi khuan đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa petri theo phương pháp cấy khuếch tán giếng thạch
Đọc kết quả:
Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng được thể hiện thông qua vòng vô khuẩn sau 1, 2 ngày sau cay được biểu thị bằng công thức:
Kích thước vòng vô khuẩn (mm) = D¡ ;¿ - d
Trong đó:
D, 23 là đường kính tương ứng của 3 vòng vô khuẩn (mm) d là đường kính vòng cấy vi sinh vật đối kháng (mm)
Tinh kháng khuẩn được biéu hiện khi vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm:
+ Kích thước vòng vô khuẩn < 5mm: tính kháng yếu
+ Kích thước vòng vô khuẩn từ 5 đến 10mm: tính kháng trung bình + Kích thước vòng vô khuẩn > 10mm: tính kháng mạnh
19
2.4.1.2 Cách tiến hành
Tiến hành bằng phương pháp cấy khuếch tán giếng thạch.
Thí nghiệm được bố trí theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 714:2006.
Dùng micropipet vô trùng hút 6 pl từ huyền phù vi khuẩn R. solanacearum cay vào dia petri chứa 20 mL môi trường SPA đã chuẩn bị sẵn.
Dùng que cấy tam giác vô trùng chang đều cho đến khi dich vi khuẩn thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không dé dịch vi khuân đính vào thành dia petri.
Đợi 20 - 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 5 mm khoan 4 lỗ thạch, loại bỏ phần thạch vừa khoan. Lưu ý dùng que cay vô trùng có mũi nhọn tách và gạt nhẹ nhàng thỏi thạch, tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ đục.
Dùng pipet vô trùng hút 6 pl nước cất vào lỗ khoan ở trung tâm dé đối chứng, 3 lỗ khoan còn lại hút 6 wl dich vi sinh vật đối kháng đưa vào mỗi lỗ khoan, giữ ở điều kiện nhiệt phòng trong thời gian 24 giờ. Sau khi cấy tránh di chuyên đĩa petri.
Khi dịch khuẩn khô lại có thé di chuyên nhưng cần nhẹ nhàng.
2.4.2 Đánh giá độc tính các dòng vi khuẩn đối kháng đối với hạt cà chua điều
kiện phòng thí nghiệm
Các dòng vi khuẩn có tính đối kháng với vi khuân gây bệnh héo xanh trên cây cà chua Ralstonia solanacearum được chon dé đánh giá trong thí nghiệm này.
Chuẩn bị:
Hạt giống cà chua Rita được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây. Ủ hạt trên giấy thấm vô trùng được làm âm đặt trong đĩa petri, giữ ở nhiệt độ phòng 25°C.
Các dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng sau 2 ngày.
Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 nghiệm thức, mỗi dòng vi khuẩn là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức là 10 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri, mỗi đĩa petri là 5 hạt và một nghiệm thức đối chứng.
Phương pháp lây nhiễm: Lây nhiễm theo phương pháp của Zhang Liquin (2001).
Khi hạt nảy mam khoảng 0,5 - 2 mm, ngâm hat vào dich vi khuẩn đã chuẩn bị trong 20 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, cấy vào đĩa petri chứa san môi trường WA, đặt ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành theo dõi trong vòng 2 tuần.
Ti lệ gây độc (%) = (Số cây bị gây độc / Tổng số cây lây nhiễm của nghiệm
thức) x 100
Vi khuẩn được xem là gây độc tinh cho cây khi có ti lệ gây độc > 0.
2.4.3 Khảo sát điều kiện nhân sinh khối tối ưu để nhân sinh khối các dòng vi khuẩn đối kháng mạnh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Lua chọn 4 dòng vi khuẩn có tính đối kháng và không có độc tính dé khảo sát các điều kiện nhân sinh khối tối ưu để nhân sinh khối vi khuẩn đối kháng mạnh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
2.4.3.1 Xác định môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp 1
Thí nghiệm được bồ trí hai yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 môi trường nhân sinh khối ứng với 4 mức thời gian với mỗi môi trường là 1 nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 bình thủy tỉnh tam giác.
Cay lần lượt các vi khuẩn vào vào 25 mL môi trường NB, NBY, LB, KBA, YDC. Sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Tiến hành theo đo ODạoạ vi khuân mỗi 12 giờ một lần.
Đọc kết quả:
Môi trường và thời gian nhân sinh khối vi khuẩn tối ưu nhất là môi trường và thời gian mà tại đó vi khuẩn đạt mật số cao nhất (ODạoo lớn nhất).
2.4.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối của các dòng vi khuẩn Dựa trên thí nghiệm trước (mục 2.4.3.1), chọn môi trường và thời gian tối ưu dé khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối của vi khuẩn.
21
Thí nghiệm đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức, với mỗi nghiệm thức là một dòng vi khuân gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại ứng với 1 ống
nghiệm.
Cấy vi khuẩn lần lượt vào 20 mL môi trường LB. Sau đó lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ 25°C, 30°C, 35°C, 40°C. Tiến hành theo đo OD¿oo sau 36 giờ đối với các dòng CC-LD 2.2, DXT1 và DXT6; sau 48 giờ đối với vi khuân ĐHTI.
Đọc kết quả:
Nhiệt độ tối ưu nhất là nhiệt độ mà tại đó vi khuẩn OD,o cao nhất mà vẫn duy trì được hoạt tính đối kháng.
2.4.3.3 Đánh giá lại khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn sau khi nhân sinh khối cấp 1
Điều kiện tối ưu để nhân sinh khối vi khuẩn là điều kiện để vi khuẩn phát triển đạt mật số tối ưu nhất mà vẫn duy trì được hoạt tính đối kháng. Vì vậy, cần bó tri thí nghiệm đánh giá lại hoạt tính đối kháng của các dòng vi khuan có hoạt tính đối kháng cao.
Dựa trên kết quả của điều kiện nhân sinh khối cấp 1 tối ưu, bố trí thí nghiệm như mục 2.4.1.1 dé khảo sát lại khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn CC-LĐ 2.2,
ĐHTI, DXT1 và DXT6.
Đọc kết quả:
Khi vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm, vi khuẩn được xem là có tính kháng.
2.4.4 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng mạnh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt cà chua trong phòng thí nghiệm
2 dòng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng mạnh nhất trong thí nghiệm trước được chon dé đánh giá khả năng đối kháng với vi khuân Ralstonia solanacearum trên
hạt cà chua.
Chuẩn bị: Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây. Ủ hạt trên giấy thấm vô trùng được làm ẩm đặt trong dia petri, giữ ở nhiệt độ phòng 27 - 30°C.
Các dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường và thời gian nhân sinh khối tối ưu nhất.
Bồ trí thí nghiệm: đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi dòng vi khuẩn đối kháng là một nghiệm thức và 3 nghiệm thức đối chứng (đối chứng vi khuẩn gây bệnh, đối chứng vi khuẩn đối kháng, đối chứng nước cất), mỗi nghiệm thức gồm 10 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 dia petri có 10 hạt cà chua.
Phương pháp thực hiện:
Thí nghiệm trừ bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 - 2 mm, ngâm hạt vào dịch vi khuẩn bệnh đã chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thắm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuan đối kháng trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thâm vô trùng, cấy vào đĩa petri chứa sẵn môi trường WA, đặt ở nhiệt
độ phòng.
Thí nghiệm phòng bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 - 2 mm, ngâm hạt vào dich vi khuẩn đối kháng đã chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuẩn bệnh trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thắm vô trùng, cấy vào dia petri chứa sẵn môi trường WA, đặt ở nhiệt
độ phòng.
Tiến hành theo dõi triệu chứng bệnh trong vòng 2 tuần:
Ty lệ bệnh (%) = (Số cây bị bệnh/ Tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức) x 100 Đánh giá hoạt tính đối kháng của vi khuẩn theo Bảng 2.3.
Bang 2.3 Mức độ hoạt tính đối kháng của vi khuẩn theo tỉ lệ gây bệnh
Tỷ lệ cây bệnh Mức độ hoạt tính đối kháng
10— 30 Hoạt tính cao 31-50 Hoat tinh kha 51-70 Hoạt tính trung bình
71—90 Hoạt tính yêu
>90 Không có hoạt tính
23
2.4.5 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng mạnh với vi
khuân Ralstonia solanacearum trong điều kiện nhà lưới
Thí nghiệm được bố trí theo tiêu chuẩn ngành 1OTCN 714:2006 có cải tiến.
Thí nghiệm đơn yếu tô hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 11 nghiệm thức với mỗi nghiệm thức là 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 3 chậu, mỗi chậu 1 cây cà chua.
Nghiệm thức 1: Xử ly vi khuẩn đối kháng ĐXTI trước, sau 7 ngày xử lý vi khuẩn gây bệnh (phòng bệnh).
Nghiệm thức 2: Xử lý vi khuân bệnh trước, sau 7 ngày xử lý vi khuẩn đối
kháng DXT1 (trừ bệnh).
Nghiệm thức 3: Xử lý đồng thời vi khuẩn bệnh ĐXTI và vi khuẩn đối kháng (hỗn
hợp).
Nghiệm thức 4: Xử lý vi khuẩn đối kháng DXT6 trước, sau 7 ngày xử lý vi khuẩn gây bệnh (phòng bệnh).
Nghiệm thức 5: Xử ly vi khuan bệnh trước, sau 7 ngày xử lý vi khuẩn đối
kháng DXT6 (trừ bệnh).
Nghiệm thức 6: Xử lý đồng thời vi khuân bệnh DXT6 và vi khuẩn đối kháng (hỗn
hợp).
Đối chứng 1: xử lý vi khuẩn gây bệnh héo xanh cùng thời điểm xử lý vi khuân
héo xanh với nghiệm thức 1 và nghiệm thức 4.
Đối chứng 2: xử lý vi khuân héo xanh cùng thời điểm xử lý vi khuẩn héo xanh
với nghiệm thức 2 và nghiệm thức 5.
Đối chứng 3: xử lí vi khuẩn đối kháng ĐXTI.
Đối chứng 4: xử lí vi khuẩn đối kháng DXT6.
Đối chứng 5: cây không xử lý khuẩn.
Chuẩn bị cây cà chua: Cà chua có 5 - 7 lá thật, sạch bệnh, sinh trưởng tốt.
Chuẩn bị dịch dịch vi khuẩn:
Dich vi khuân héo xanh: Nuôi vi khuân Ralstonia solanacearum trong môi trường LB ở nhiệt độ phòng.
Sau 48 giờ, pha loãng vi khuẩn trong nước cất vô trùng dé đạt mật độ 6x10”
CFU/mL.
Dịch vi sinh vật đối kháng: Vi sinh vật đối kháng được nuôi cấy trong môi trường tối ưu nhất đến khi đạt mật số 10” - 10'° CFU/mL.
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo tiêu chuân ngành 10TCN 714:2006 có cải tiễn.
Nghiệm thức 1: tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuẩn đối kháng (10° CFU/mL), sau 7 ngày, tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuẩn bệnh Ralstonia solanacearum (6.10°CFU/mL).
Nghiệm thức 2: tưới lên vùng đất mặt quanh gốc ca chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuẩn bệnh Ralstonia solanacearum (6x10 CFU/mL), sau khi cây biểu hiện bệnh đạt 30% tong số cây trong nghiệm thức, tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuẩn đối kháng (10? CFU/mL).
Nghiệm thức 3: tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuẩn bệnh Ralstonia solanacearum (6x10Ÿ CFU/mL), ngay sau đó tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuẩn đối kháng (10°
CFU/mL).
Đối chứng 1: tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10mL/chậu huyền phù vi khuẩn bệnh Ralstonia solanacearum (6x10 CFU/mL) tại thời điểm sau 7 ngày xử ly vi khuẩn đối kháng ở nghiệm thức 1.
Đối chứng 2: tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chậu huyền phù vi khuan bệnh Ralstonia solanacearum (6x10°CFU/mL).
Đối chứng 3: tưới lên vùng đất mặt quanh gốc cà chua 10 mL/chau huyền phù vi khuẩn đối kháng (10? CFU/mL).
Đối chứng 4: không nhiễm khuẩn cho cây.
29
Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành lấy chỉ tiêu ngay sau khi tất cả các cây trong đối chứng 1 bắt đầu xuất hiện biéu hiện bệnh.
Ti lệ bệnh (%) = (Số cây bị bệnh / Tổng số cây của nghiệm thức) x 100 (Cây bị bệnh là cây có ít nhất 1 lá bị héo rũ)
Đánh giá mức độ hoạt tính đối kháng của vi khuẩn theo Bảng 2.3.
2.5 Xử lý số liệu
Các số liệu được tổng hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel
2010.
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân
hang Duncan sử dụng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3