CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Phục hồi vi khuẩn: Vi khuẩn được lấy ra từ tủ âm -80oC, sau đó rã đông và được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C. Sau 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn (Phụ lục A).
Nếu vi khuẩn không đảm bảo tính thuần, tiến hành chọn những khuẩn la ̣c rời và có hình dạng đặc trưng của vi khuẩn đem đi tách ròng , các thao tác phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Nuôi tăng sinh: Sau khi có được vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 1-2 khuẩn lạc cho vào môi trường BHI-B đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
3.3.2 Phương pháp định danh vi khuẩn
Vi khuẩn được định danh dựa theo tài liệu của Buller (2004) và cẩm nang Cowan and Steel’s (1993). Các chủng vi khuẩn sau khi được tách ròng, kiểm tra các đặc điểm về hình thái, sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng cách test các chỉ tiêu cơ bản (Primary test) như: nhuộm Gram, phản ứng Catalase, Oxidase, phản ứng O/F, tính di động (Phụ lục A).
3.3.3 Bố trí thí nghiệm
a. Thí nghiệm 1: Kiểm tra tính nhạy của thảo dƣợc (lá ổi, cỏ mực và diệp hạ châu) trên vi khuẩn Streptococcus sp.
Phương pháp 1: Khuếch tán trên đĩa thạch - Chuẩn bị thí nghiệm:
Chuẩn bị vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn Streptococcus sp. được phục hồi và đảm bảo tính thuần lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý 0,85% đã qua tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD=1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn là 109 CFU/ml. Sau đó dung di ̣ch vi khuẩn đươ ̣c pha loãng đến nồng độ là 105 CFU/ml.
Chuẩn bị đĩa giấy: Đĩa giấy được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 180oC. Sau đó được tẩm với chất chiết xuất thảo dược ở các nồng độ 25, 50 và 100% khoảng 30 phút (tương tự cho cả 3 loại thảo dược). Lấy để ra đĩa Petri phơi khô ở nhiệt độ phòng (mỗi nồng độ lặp lại 5 lần). Tất cả các thao tác được làm trong điều kiện vô trùng.
Tiến hành thí nghiệm:
Cho dung dịch có chứa vi khuẩn có nồng độ pha loãng 105 CFU/ml lên môi trường thạch TSA. Dùng tăm bông tiệt trùng tẩm vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch. Sau đó dùng pel tiệt trùng lấy đĩa giấy Whatman đã được tẩm thảo dược dán vào đĩa Petri. Mỗi đĩa petri đặt 4 đĩa giấy cách đều nhau (3 đĩa giấy có tẩm chất chiết xuất theo các nồng độ và 1 đĩa giấy tẩm nước cất vô trùng). Tất cả được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Sau đó đặt đĩa petri đã dán đĩa giấy vào tủ ấm ở điều kiện 28oC. Sau 48 giờ tiến hành đọc kết quả.
- Đọc kết quả
Dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp. Đo đường kính vòng vô trùng (mm).
Phương pháp 2: Phương pháp đục lỗ thạch
Sau khi chuẩn bị môi trường thạch TSA, đã được tiệt trùng ở 121oC, để môi trường nguội dần khoảng 45-50oC. Cho dung dịch vi khuẩn Streptococcus sp.
đã kiểm định vào môi trường thạch với tỉ lệ thích hợp để đạt vi khuẩn có nồng độ 105 CFU/ml. Lắc đều và tiến hành đổ môi trường có chứa dung dịch vi khuẩn ra đĩa Petri và để thạch đặc lại. Sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Ở mỗi đĩa đục 4 lỗ, đường kính khoảng 5 mm/lỗ, trong đó 3 lỗ để chứa dịch chiết thảo dược ở các nồng độ 25, 50 và 100% và 1 lỗ để chứa nước cất vô trùng. Cho vào mỗi lỗ 0,1 ml dịch chiết (lỗ đối chứng sử dụng nước cất vô trùng) sau đó ủ ở nhiệt độ 28oC. Sau 48 giờ tiến hành xác định đường kính vòng tròn kháng khuẩn. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần với mỗi loại thảo dược.
Lưu ý: Mọi thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
b. Thí nghiệm 2: Tác dụng của thảo dƣợc phòng bệnh đen thân trên cá rô (Anabas testudineus)
Tiến hành thí nghiệm cho ăn Chuẩn bị hệ thống bể:
Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và Chlorin 200 ppm, phơi khô, sau đó cấp nước vào. Đối với bể 2 m3 để trữ cá được cấp nước khoảng 2/3 bể, sục khí 2 ngày trước khi thí nghiệm. Nguồn sử dụng là nguồn nước máy. Các dụng cụ thí nghiệm như xô, vợt, ống sục khí, đá bọt,…cũng được vệ sinh kỹ.
Bố trí 7 bể cho 7 nghiệm thức cho ăn.
Cá thí nghiệm:
Cá rô đồng giống có trọng lượng khoảng 6-10 g/con, cá khỏe và phản ứng linh hoạt với tiếng động. Cá mua về được trữ trong bể Composite (250 L), sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp, 1 ngày cho ăn 2 lần và lượng thức ăn theo nhu cầu của cá. Bố trí 40 con/bể.
Cho ăn thảo dược liên tục trong 3 tuần với 7 nghiệm thức:
(1) Nghiệm thức 1: Cho cá ăn thức ăn không có bổ sung chiết xuất thảo dược (đối chứng âm).
(2) Nghiệm thức 2: Cho cá ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất cỏ mực với liều lượng 3 ml/kg thức ăn.
(3) Nghiệm thức 3: Cho cá ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất cỏ mực với liều lượng 6 ml/kg thức ăn.
(4) Nghiệm thức 4: Cho cá ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu với nồng độ 3 ml/kg thức ăn.
(5) Nghiệm thức 5: Cho cá ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu với nồng độ 6 ml/kg thức ăn.
(6) Nghiệm thức 6: Cho cá ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất lá ổi với nồng độ 3 ml/kg thức ăn.
(7) Nghiệm thức 7: Cho cá ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất lá ổi với nồng độ 6 ml/kg thức ăn.
Các liều lượng được pha với nước cất thành 100 mL, cho vào bình phun sương, phun đều lên viên thức ăn, để khô tự nhiên và tiến hành cho cá ăn.
Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm Chuẩn bị hệ thống bể:
Bể nhựa 60 mL được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và Chlorin 200 ppm, phơi khô, sau đó cấp nước vào khoảng 2/3 bể, sục khí 2 ngày trước khi thí nghiệm.
Nguồn sử dụng là nguồn nước máy. Các dụng cụ thí nghiệm như xô, vợt, ống sục khí, đá bọt,…cũng được vệ sinh kỹ. Không thay nước trong suốt quá trình cảm nhiễm.
Cá thí nghiệm: Nguồn cá lấy từ thí nghiệm cho ăn thức ăn có bổ sung thảo dược liên tục trong 3 tuần ở trên để bố trí cho các nghiệm thức gây cảm nhiễm. Bố trí 10 con/bể. Cho ăn thức ăn không bổ sung thảo dược 2 ngày/lần theo nhu cầu của cá (cho vừa đủ tránh làm dơ nước).
Chuẩn bị vi khuẩn:
Vi khuẩn gây cảm nhiễm được lấy từ Bộ môn Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C. Sau 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Sau khi có được vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 1-2 khuẩn lạc cho vào môi trường BHI-B đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50 mL tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý đã được thanh trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).
Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên cho vào khoảng 25 mL dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn mẫu bằng máy Vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn. OD=1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn là 0,91 x 109 CFU/ml. Sau đó dung di ̣ch vi khuẩn đươ ̣c pha loãng đến các nồng đô ̣ thí nghiê ̣m cần th iết là 3,65 x 105 CFU/ml (LD50).
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức đều tiêm vi khuẩn, kể cả nghiệm thức cá cho ăn thức ăn không bổ sung thảo dược (NT2:
đối chứng dương) và 1 nghiệm thức cá cho ăn thức ăn không bổ sung thảo dược được tiêm nước muối sinh lý (NT1: đối chứng âm). Như vậy, sẽ có 8 nghiệm thức được bố trí gồm: (1) NT1: Đối chứng âm; (2) NT2: Đối chứng dương; (3) NT3: Cá cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất cỏ mực 3 ml; (4) NT4: Cá cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất cỏ mực 6 ml; (5) NT5: Cá cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu 3 ml; (6) NT6: Cá cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu 6 ml; (7) NT7: Cá cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất lá ổi 3 ml; (8) NT8: Cá cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất lá ổi 6 ml.
Mật độ vi khuẩn tiêm vào cá dựa trên cơ sở thí nghiệm xác định LD50 của Nguyễn Khương Duy (2011) là 3,65 x 105 CFU/ml. Cá được tiêm với liều lượng là 0,1 ml vi khuẩn cho mỗi con và tiêm ở gốc vi ngực của cá. Bố trí thêm nghiệm thức đối chứng âm tiêm nước muối sinh lý. Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần (riêng đối chứng âm không cần lặp lại).