Phương pháp đục lỗ thạch

4.1 Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính nhạy của thảo dược trên vi khuẩn

4.1.2 Phương pháp đục lỗ thạch

Kết quả thử nghiệm ban đầu trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy dịch chiết nguyên chất từ cây cỏ mực và diệp hạ châu có tính kháng khuẩn tốt đối với vi khuẩn Streptococcus sp. và giảm dần ở các mức pha loãng. Khả năng kháng khuẩn của hai loại này khá tương đồng với vòng kháng khuẩn cao nhất ở nồng độ 100% là 15 mm và thấp nhất ở nồng độ 25% là 9 mm (sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các mức nồng độ với p<0,05). Lá ổi chỉ có vòng kháng khuẩn ở nồng độ 100% (7,4±0,55 mm) và khả năng kháng rất thấp.

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng dịch chiết lên khả năng kháng khuẩn

Thảo dược Nồng độ (%)

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

Cỏ mực Diệp hạ châu Lá ổi

100 14,6±0,55c 14,6±0,55c 7,4±0,55c

50 12,6±0,55b 12,8±0,45b 0

25 9,6±0,55a 10,4±0,55a 0

Đối chứng 0 0 0

Các giá trị trong cùng 1 cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Tuy nhiên, chiết xuất từ diệp hạ châu kháng khuẩn Streptococcus sp. tốt hơn cỏ mực vì vòng kháng rõ ràng hơn. Theo nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2011) về khả năng kháng khuẩn của cỏ mực thu tại khu vực ĐBSCL cho thấy

chúng có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản trong đó điển hình nhất là Edwardsiella tarda, riêng đối với vi khuẩn Streptococcus sp. mức độ kháng khuẩn ở mức trung bình tùy nồng độ. Theo nghiên cứu của Đoàn Chí Thanh và ctv (2009) cho rằng hiệu lực kháng khuẩn của cỏ mực đối với vi khuẩn Aeromonas sp. ở mức kém (6,8-7,2 mm).

Hình 4.1 Kết quả thử nghiệm tính kháng khuẩn của thảo dược với vi khuẩn Streptococcus ở các nồng độ khác nhau. A: Kết quả vòng kháng khuẩn của

diệp hạ châu; B: Kết quả vòng kháng khuẩn của cỏ mực.

Như vậy, kết quả thử nghiệm đối với vi khuẩn Streptococcus spp. cho thấy khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cỏ mực ở mức tốt hay kém tùy vào nồng độ thảo dược. Đối với diệp hạ châu cũng tương tự với cỏ mực với đường kính vòng tròn kháng khuẩn tương đương nhau. Vi khuẩn có tính mẫn cảm cao ở nồng độ 100% với đường kính vòng kháng khuẩn đo được là 14,6 mm, vi khuẩn mẫn cảm yếu hơn ở nồng độ 50 và 25% của chiết xuất cỏ mực lần lượt là 12,6 mm và 9,6 mm, diệp hạ châu cao hơn với 12,8 mm và 10,4 mm. Cũng theo Huỳnh Kim Diệu (2011) diệp hạ châu có tác dụng yếu đến Streptococcus faecalis với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 2048- 4096 μg/ml. Trên thế giới và Việt Nam hầu như các nghiên cứu về dịch chiết lá ổi đều chủ yếu thử nghiệm trên động vật trên cạn, người ta cũng cho rằng hợp chất từ lá và vỏ thân có tác dụng sát trùng trên các vi khuẩn Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Pseudomonas,…Dịch ép từ lá pha với nước muối tỉ lệ 1: 40 có tác dụng diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus. Hay nước ép tươi từ lá ở nồng độ 66% có hoạt tính diệt siêu vi khuẩn bệnh khảm cây thuốc lá. Tuy nhiên, việc nghiên cứu kháng khuẩn của dịch chiết lá ổi đối với vi khuẩn Streptococcus sp. gây bệnh trên động vật thủy sản chưa được nghiên cứu trước đây.

Vì thế đối với nghiên cứu thử nghiệm tính kháng khuẩn của lá ổi, diệp hạ châu và cỏ mực với vi khuẩn Streptococcus sp. trên thủy sản ban đầu đã cho kết quả khả quan với dịch ép nguyên chất của cỏ mực và diệp hạ châu, còn dịch chiết lá ổi tuy có khả năng kháng khuẩn Streptococcus sp. nhưng mức độ thu được

A B

chỉ ở mức kém (>7,0 mm) ở nồng độ 100%. Theo Patela (2011), chất chiết xuất với cồn của diệp hạ châu được chứng minh là có hoạt tính cao nhất chống lại Salmonella Typhi qua phương pháp khuếch tán trên thạch với đường kính vòng vô khuẩn là 8,0 mm so với đường kính vòng vô khuẩn của ciprofloxacin, ofloxacin và amoxicillin lần lượt là 9,0; 6,0 và 4,0 mm. Dịch chiết trong nước và trong methanol của lá cây ở nồng độ 100 mg/ml được kiểm tra với E. coli, Streptococcus sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp. và Staphylococcus. Kết quả cho thấy dịch chiết thô ức chế E. coli, Streptococcus và S. aureus. Cũng theo nghiên cứu của Nguyễn Thành Tâm và ctv (2011) sử dụng chiết xuất từ cây diệp hạ châu đỏ và diệp hạ châu xanh đều có kết quả kháng khuẩn tốt với vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp đục lỗ thạch Điều này cho thấy chất chiết xuất từ diệp hạ châu khá nhạy với vi khuẩn Streptococcus sp. phù hợp với kết quả thử nghiệm.

4.2 Kết quả thí nghiệm tìm hiểu tác dụng của thảo dƣợc phòng bệnh đen thân trên cá rô (Anabas testudineus)

Sau 3 tuần cho ăn thức ăn có trộn thảo dược nhận thấy có sự tăng miễn dịch không đặc hiệu ở cá, tiến hành cảm nhiễm với vi khuẩn Streptococcus sp.. Dấu hiệu bệnh xuất hiện sau 2 ngày cảm nhiễm, phần lưng trên cơ thể cá chuyển màu sậm lại và có thể nhìn thấy rõ khi nhìn từ bể xuống, não cá cũng có màu đen sậm dễ nhận biết, cá bơi lội lờ đờ quanh mặt nước phản ứng chậm với tiếng động, bụng cá trương to, xuất huyết, đặc biệt vây đuôi và vây hậu môn bị ăn mòn nghiêm trọng. Các biểu hiện thần kinh thường xuất hiện với cá bị nhiễm cấp tính như bơi lội bất thường, bơi xoáy vòng quanh bể sau đó chìm dần xuống đáy và chết rất nhanh, cơ thể cá bị xay xát nặng, vùng đuôi bị mất vẩy, vùng miệng và vây bị ăn mòn.

Giải phẫu bên trong nội tạng cá thấy xoang bụng chứa nhiều dịch máu, gan sưng to dẫn đến xuất huyết. Bên cạnh đó, bệnh cũng xuất hiện các dấu hiệu mãn tính không làm cá chết ngay nhưng kéo dài suốt thời gian cá bệnh làm cá yếu dần và chết rải rác. Dấu hiệu bệnh lý của cá rô trong thí nghiệm này sau khi cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp. giống như mô tả của Nguyễn Khương Duy (2011) và Huỳnh Thị Ngọc Thanh (2012).

Hình 4.2 Biểu hiện của cá bệnh trước và sau khi giải phẫu. A: Cá xuất hiện các đốm đen trên cơ thể; B: Nội tạng bên trong bị xuất huyết.

A B

Qua biểu đồ ở Hình 4.6 cho thấy tỷ lệ cá chết tích lũy cao nhất ở NT2 đạt 46,7%, kế đến là NT7 với tỷ lệ chết là 43,3%, NT3 và NT8 có tỷ lệ chết là 26,7%. Tỷ lệ chết thấp nhất ở NT4, NT5 và NT6 lần lượt là 13,3%, 13,3% và 10%. Thời gian cá bắt đầu chết sau khi tiêm vi khuẩn ở các nghiệm thức thì khác nhau, trong đó NT2 và NT7 cá bắt đầu chết từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 13, NT8 cá bắt đầu chết từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 12, NT3 cá bắt đầu chết từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 13, NT4 cá bắt đầu chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 11, NT5 cá chết từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 12. Riêng NT6 đến ngày thứ 8 cá mới bắt đầu chết và ngưng chết ở ngày thứ 12. NT1 (đối chứng âm) không chết chứng tỏ cá thí nghiệm là cá khỏe và không bị lỗi thao tác. Dựa vào kết quả của biểu đồ trên cho thấy tỷ lệ sống sau 14 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn Streptococcus sp. giữa các nghiệm thức có khác nhau. NT6 có tỷ lệ sống cao nhất là 90%, NT4 và NT5 có tỷ lệ sống thấp hơn là 86,7% (khác biệt không có ý nghĩa thống kê với NT6 p>0,05), tỷ lệ sống thấp nhất ở NT2 là 53,3%.

Tương tự, NT3 và NT8 có tỷ lệ sống tương đương nhau là 73,3% (khác biệt có ý nghĩa thống kê với NT6 và NT2 (p<0,05). Ở NT7 có tỷ lệ sống là 56,7% cao hơn NT2 và thấp hơn các nghiệm thức còn lại (khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05).

Điều này cho thấy rằng thức ăn có bổ sung thảo dược giúp cá đề kháng lại sự cảm nhiễm bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. gây ra tốt hơn tùy từng loại thảo dược cũng như nồng độ bổ sung vào thức ăn. Từ kết quả thu được có thể thấy rằng ở NT6 cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu 6 ml/kg thức ăn có tỷ lệ sống cao nhất, tiếp đến là nghiệm thức có bổ sung diệp hạ châu 3 ml và cỏ mực 6 ml/kg thức ăn, nghiệm thức có bổ sung cỏ mực 3 ml và nghiệm thức có bổ sung chiết xuất lá ổi 6 ml/kg thức ăn cho kết quả khá tốt.

Thấp nhất là nghiệm thức có bổ sung lá ổi 3 ml. Qua đó có thể thấy rằng, tùy loại thảo dược mà hiệu quả tác dụng ở các nồng độ là khác nhau. Như ở diệp hạ châu cho thấy khi bổ sung ở nồng độ 3 ml/kg thức ăn đã có tác dụng tốt như 6 ml/kg (khác biệt không có ý nghĩa p>0,05). Tuy nhiên ở cỏ mực khi bổ sung chiết xuất ở nồng độ 6 ml cho kết quả tốt hơn ở nồng độ 3 ml (khác biệt có ý nghĩa p<0,05). Kết quả thu được cũng phù hợp với thí nghiệm thăm dò ở trên đối với chiết xuất lá ổi ở nồng độ 6 ml có tác dụng tương tự như chiết xuất cỏ mực 3 ml góp phần nâng cao tỷ lệ sống so với đối chứng dương. Mặc khác, khi bổ sung chiết xuất lá ổi 3 ml/kg thức ăn không làm tăng tỷ lệ sống cao như 6 ml/kg thức ăn (khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05). Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu trên cá tra của Nguyễn Hồng Loan (2010) khi tiến hành cảm nhiễm với vi khuẩn Edwarsiella ictaluri sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất từ cây hoàng kỳ, giúp nâng cao tỷ lệ sống của cá.

Theo Dugenci et al. (2003) sử dụng chiết chất từ cây tầm gửi (Viscum album), cây tầm ma (Urtica dioica) và cây gừng (Zingiber officinale) cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss) ăn với khẩu phần 0,1; 1 và 5% trọng lượng thân/ngày liên tục trong 3 tuần. Kết quả cá ăn thức ăn có bổ sung chiết chất thảo dược thì hoạt động hô hấp tăng đáng kể (P<0,0001) so với nhóm đối chứng. Ở cá Tráp (Pseudosciaena crocea), khi cho cá ăn 1-1,5% hỗn hợp Hoàng kỳ (Radix astragali seu Hedysari) và Đương quy (Radix angelicae sinensis) với tỷ lệ 5: 1 thì hệ miễn dịch cá được tăng cường và tỷ lệ sống được cải thiện (Jian và Wu, 2003).Trên cá rô phi, Pachanawan et al. (2008) chứng minh có thể sử dụng lá ổi (Psidium guajava) để kiểm soát bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra. Một nghiên cứu khác của Zheng et al. (2009) chứng minh khi thêm tinh dầu cây lá thơm (Origanum heracleoticum) vào khẩu phần thức ăn cá nheo (Ictalurus punctatus) bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết (Aeromonas hydrophila) thì cá vẫn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa (P<0,005) so với đối chứng. Huỳnh Kim Diệu (2011) sử dụng bột lá xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum) bổ sung vào thức ăn của cá tra khi gây cảm nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A.

hydrophila gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn Edwardsiellla ictaluri gây bệnh mủ gan thì tỉ lệ chết (11,67 và 15%) ở các nghiệm thức cho cá ăn thức ăn sổ sung bột lá xuân hoa (liều 20 g/kg thức ăn) thấp hơn cá ở lô đối chứng (28,33 và 33,33%).

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

ĐC âm ĐC dương Mực 3 Mực 6 DHC 3 DHC 6 Ổi 3 Ổi 6

Hình 4.3 Tỷ lệ cá chết tích lũy sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp.

Thời gian (ngày) Tỷ lệ chết tích lũy(%)

4.3 Kết quả ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên các chỉ tiêu huyết học của cá rô trước và sau cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp.

4.3.1 Trước cảm nhiễm Hồng cầu

Kết quả cho thấy sau 3 tuần thí nghiệm số lượng tế bào hồng cầu trung bình giữa các nghiệm thức dao động từ 2,39 x 106 tế bào/ml đến 3,53 x 106 tế bào/ml và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức thí nghiệm (Hình 4.4).

Hình 4.4 Số lượng tế bào hồng cầu của các nghiệm thức sau 3 tuần. NT1 Cho ăn thức ăn không bổ sung thảo dược. NT2 Cho thức ăn có bổ sung chiết xuất cỏ mực 3 ml/kg thức ăn. NT3 Cho thức ăn có bổ sung chiết xuất cỏ mực 6 ml/kg thức ăn. NT4 Cho thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu 3 ml/kg thức ăn. NT5 Cho thức ăn có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu 6 ml/kg thức ăn.

NT6 Cho thức ăn có bổ sung chiết xuất lá ổi 3 ml/kg thức ăn. NT7 Cho thức ăn có bổ sung chiết xuất lá ổi 6 ml/kg thức ăn.

Kết quả phân tích cho thấy ở NT1 có số lượng tế bào hồng cầu thấp nhất, tất cả các nghiệm thức còn lại đều cao hơn có ý nghĩa thống kê so với NT1 (p<0,05). NT5 có số lượng tế bào hồng cầu cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác. NT6 có số lượng tế bào hồng cầu thấp hơn NT7 (khác biệt có ý nghĩa p<0,05) cho thấy ở lá ổi khi bổ sung vào khẩu phần ở nồng độ cao hơn sẽ cho kết quả tốt hơn. NT2 và NT7 khác biệt không có ý nghĩa dù NT2 có số lượng tế bào hồng cầu cao hơn, điều đó chứng tỏ chiết xuất cỏ mực có tác dụng tăng cường sự sống và tuần hoàn máu tối ưu hơn lá ổi. Tiếp đến là NT2, NT3 và NT4 có số lượng hồng cầu trung bình lần lượt là

Hồng cầu

0 50 100 150 200 250 300 350 400

1 2 3 4 5 6 7

Hồng cầu Tế bào x 104/ml

Nghiệm thức

3,12 x 106; 3,3 x 106 và 3,39 x 106 tế bào/ml (khác biệt này có ý nghĩa thống kê p<0,05 ở NT2 và 2 NT còn lại, NT3 và NT4 khác biệt không có ý nghĩa p>0,05). Còn ở NT5 cao hơn các nghiệm thức khác có ý nghĩa thống kê điều đó chứng tỏ đối với diệp hạ châu khi bổ sung ở nồng độ cao sẽ mang lại hiệu quả tối ưu nhất. Tuy nhiên ở nồng độ thấp chiết xuất diệp hạ châu vẫn cho kết quả tốt. Chiết xuất lá ổi tuy ở thí nghiệm 1 không mang lại kết quả cao khi thử hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus sp. trong phòng thí nghiệm, nhưng ở thí nghiệm cho ăn lại cho kết quả khả quan góp phần tăng khả năng miễn dịch đáng kể cho cá. Điều này rất có ý nghĩa ứng dụng trong thực tế.

Qua đó cho thấy khi bổ sung chiết xuất thảo dược vào thức ăn góp phần làm tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu ở các nghiệm thức, số lượng tế bào hồng cầu tăng giúp vận chuyển và phân phối oxy đến các mô tốt hơn, điều đó còn tùy thuộc vào từng loại thảo dược và nồng độ mà nó tác động đến. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Hồng Loan (2010) khi so sánh lượng hồng cầu giữa cá tra cho thức ăn có bổ sung chiết xuất hoàng kỳ với đối chứng không cho ăn bổ sung hoàng kỳ. Hay nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2011) sử dụng bột lá xuân hoa bổ sung vào thức ăn của cá tra với liều 15 g/kg thức ăn và cho cá ăn trong 1 tháng thì cá tăng trọng hơn nghiệm thức đối chứng là 27%. Ở nghiệm thức cho ăn bổ sung bột lá xuân hoa liều 20 g/kg thức ăn thì tỉ lệ sống là 98,3% cao hơn so với lô đối chứng (88,3%). Qua đó cho thấy tuy thảo dược khác nhau nhưng khi bổ sung vào khẩu phần thức ăn đều làm tăng cường hoạt động của các tế bào máu dẫn đến số lượng tế bào hồng cầu tăng và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (p<0,05) góp phần làm tăng khả năng miễn dịch của cá. Theo Nguyễn Hoàng Nam (2011) tìm hiểu ảnh hưởng chiết xuất từ cây Yucca và Quiliaja đến chỉ tiêu huyết học của cá tra nhận định khi bổ sung chiết xuất thảo dược thì tốc độ tăng trưởng của cá tăng, mật độ tế bào hồng cầu tăng và thể hiện rõ ở nghiệm thức cho ăn với nồng độ cao (500 mg/kg thức ăn)

Bạch cầu

Tổng tế bào bạch cầu

Sau 3 tuần cho ăn thức ăn có bổ sung thảo dược, số lượng tổng bạch cầu (TBC) ở NT4 là cao nhất, tiếp theo là NT5 (khác biệt không có ý nghĩa p>0,05), đến NT3 và NT2 khác biệt giữa 2 nghiệm thức này cũng không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tương tự, NT7 và NT6 thấp hơn và khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa 2 nghiệm thức (p>0,05). Riêng NT1 (đối chứng) có TBC thấp nhất trong các nghiệm thức và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

với tất cả các nghiệm thức còn lại. Điều đó chứng tỏ khi bổ sung diệp hạ châu ở nồng độ 3 ml/kg thức ăn đã có tác dụng tốt trong việc kích thích và làm gia tăng hoạt động của bạch cầu. Kết quả trên cũng tương tự cho cả chiết xuất cỏ mực và lá ổi, tuy số lượng TBC ở nồng độ cao khi bổ sung vào thức ăn cho cá có cao hơn nồng độ thấp nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa, vì thế cho thấy để tiết kiệm thảo dược nên sử dụng chiết xuất ở nồng độ thấp vẫn mang lại kết quả cao. Đặc biệt, qua sự so sánh ở trên cho thấy chiết xuất từ diệp hạ châu cho hiệu quả tốt nhất, kế đến là cỏ mực và cuối cùng là lá ổi. Theo nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi (2010) thì số lượng TBC của cá tra ở nghiệm thức cho ăn thức ăn bổ sung chiết xuất hoàng kỳ tăng dần và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với cá ở nghiệm thức không cho ăn thức ăn bổ sung hoàng kỳ. Kết quả của Ardó et al. (2008) cho thấy trộn chiết chất từ cây Hoàng kỳ và Kim ngân vào thức ăn có thể tăng cường hệ miễn dịch cá chép và cá rô phi (Oreochromis niloticus).

Hình 4.5 Số lượng tổng tế bào bạch cầu của các nghiệm thức sau 3 tuần.

Tế bào bạch cầu đơn nhân

Có thể thấy kết quả so sánh số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân cao nhất ở NT5 có bổ sung chiết xuất diệp hạ châu 6 ml, tiếp đến là NT6, NT7 và NT4 (các nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa p>0,05). NT3 và NT2 có số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân thấp hơn và 2 nghiệm thức này cũng không khác biệt có ý nghĩa. Tuy nhiên tất cả các nghiệm thức trên đều cao hơn đối chứng (khác biệt có ý nghĩa p<0,05) (Hình 4.8). Qua đó cho thấy diệp hạ châu có tác dụng giúp tăng cường miễn dịch tốt nhất, đặc biệt ở nồng độ 6 ml tiếp đến là lá ổi và cuối cùng là cỏ mực. Cũng theo nghiên cứu của Yin et al.

(2006) khi bổ sung 0,1-0,5% Hoàng kỳ (Astragalus radix) vào thức ăn làm tăng hàm lượng lysozyme của cá rô phi sau 1 tuần và hoạt động thực bào của tế bào thực bào tăng sau 3 tuần. Chiết xuất từ cây Hoàng kỳ cũng đã được thử

Tổng bạch cầu

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00

1 2 3 4 5 6 7

Tổng bạch cầu

Nghiệm thức Tế bào x 104/ml