Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3 Phương pháp thí nghiệm
3.3.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
Các chỉ tiêu kiểm tra: tổng vi khuẩn hiếu khí, tổng số Escherichia coli, Salmonella, tổng sốStaphylococcus aureus
Phương pháp pha loãng mẫu
Mẫu tăm bông trên thân thịt heo, kệ giết mổ, dao và bàn pha lóc thịt: mẫu được cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý (0,9%) khi lấy mẫu, đưa vào máy Votex đồng nhất mẫu, được dung dịch pha loãngở nồng độ 10-1. Dùng micropipette vô trùng hút 1 ml dung dịch nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý, trộn đều, được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2, tiếp tục các thao tác pha loãngđể pha loãngđến các nồng độ tiếp theo.
Mẫu nước: dùng micropipette vô trùng hút 1ml nước cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều, được dung dịch pha loãng ở nồng độ 10-1. Dùng pipete vô trùng hút 1ml dung dịch nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý, trộn đều, được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục các thao tác tương tự để pha loãngđến các nồng độ tiếp theo.
Sơ đồ 5: Quy trìnhđịnh lượngtổngvi khuẩn hiếu khí,E. coli, Staphylococcus aureus Mẫu
9ml
10-3 9ml
10-1
9ml
10-2
9ml
10-4 1ml 1ml 1ml 1ml
Môi trường MC
Đếm khuẩn lạc E. coli
Môi trường MSA
Đếm khuẩn lạc Staphylococcus
aureus
Kiểm tra sinh hóa
Kết luận E. coli
Kiểm tra sinh hóa
Kết luận
Staphylococcus aureus
Môi trường NA 9ml
10-5
Đếm khuẩn lạc tổng số vi khuẩn
hiếu khí
Tính kết quả
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TCVN 5667:1992)
Để xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo sơ đồ 5 và môi trường để nuôi cấy làmôi trường NA. Nuôi cấy ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp có kết quả dự kiến 25 - 300 khuẩn lạc trong 1ml. Sau đó ủ ở 370C trong 24 giờ.
Cách tính kết quả: đếm tất cả các khuẩn lạc có trong đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-300 để tính kết quả theo công thức dưới đây
X: tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dm2 mẫu thử.
C: tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa ở hai độ pha loãng liên tiếp.
V: thể tích dung dịchlấy để định lượng n1: số đĩa ở độ pha loãng thứ 1 được đếm.
n2: số đĩa ở độ pha loãng thứ 2 được đếm.
d: hệ số pha loãng thứ nhất đếm được
Xác định tổng số Escherichia coli
Định lượngE. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theoTCVN 5155:1990 Tiến hànhđịnh lượngE. coli theo sơ đồ 5.
Nuôi cấy trên môi trường MC định lượng E. coli, trên môi trường MC thì các khuẩn lạcE. coli tròn, khô, có màuđỏ, hìnhđĩa.
Sau đó vi khuẩn được cấy chuyển để làm thuần trên các môi trườngMC vàủ 370C trong 24 giờ để kiểm tra các phản ứng sinh hoá củaE. coli.
Phản ứng indole: E. coli có phản ứng dương tính, lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ (E. coli không điển hình có phản ứng màu vàng nhạt).
Phản ứng đỏ methyl red: E. coli có phản ứng dương tính màu đỏ (âm tính:
màu vàng)
Phản ứng Voges – Proskauer: E. coli có phản ứng âm tính, không màu hoặc màu vàng nhạt (dương tính: màu đỏ).
C X =
V.d.(n1 + 0,1n2)
Trên môi trường Simmon citrate: E. coli có phản ứng âm tính, thạch màu xanh dương.
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Các nồng độ cho kết quả từ 10 - 100 khuẩn lạc là đạt chuẩn của phương pháp xác định tổng số vi khuẩn. Tổng số vi khuẩn E. coli đuợc tính tương tự phương pháp định lượng TSVKHK.
Xác định vi khuẩnStaphylococcus aureus
Định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 5156:1990
Các bước tiến hành tương tự phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, pha loãng theo sơ đồ 4.
Sử dụng môi trường MSA định lượng Staphylococcus aureus. Trên môi trường MSA: khuẩn lạc Staphylococcus aureus mọc kích thước nhỏ, tròn, màu vàng, rìa gọn, khô, môi trường từ đỏ chuyển sang vàng.
Sau đó vi khuẩn được cấy chuyển để làm thuần trên các môi trường chuyên biệt cho từng loại vi khuẩn và cấy sang môi trường NA ủ 370C trong 24 giờ để kiểm tra các phản ứng sinh hoá để khẳng định Staphylococcus aureus chọn khuẩn lạc điển hình thử phản ứng đông huyết tương, ủ 370C trong 4 - 6 giờ, và thử khả năng dung huyết trên thạch máu. Kết quảStaphylococcus aureus (+) khi phản ứng đông huyết tương (+), và phản ứng dung huyết (+).
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ.Các nồng độ cho kết quả từ 10 - 100 khuẩn lạc là đạt chuẩn của phương pháp xác định tổng số vi khuẩn.Tổng số vi khuẩn Stap. aureus đuợc tính tương tự phương pháp định lượng TSVKHK.
Xác định Salmonella (TCVN 5153:1990)
Lấy mẫucho vào 25ml môi trường tiền tăng sinh BufferedPeptone Water,ủ ở 370C/ 24 giờ.
Dùng micropipette vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm có chứa 25ml môi trường tăng sinh Hajna Tetrathionate Broth , ủ ở 370C/ 24 giờ.
Lấy một vòng que cấy từ môi trường tăng sinh, cấy chuyển lên 2 môi trường BGA và MLCB. Sau khi cấy đem ủ ở nhiệt độ 370C, trong 24 giờ. Trên BGA, khuẩn lạc có màu đỏ nhạt, môi trường có màu đỏ, khuẩn lạc tròn bóng, bề mặt hơi
lồi và trên MLCB khuẩn lạcSalmonella to, màu đen viền xám nhạt, bề mặt hơi lồi, môi trường có màu tím xanh.
Kiểm tra đặc tính sinh hoá vi khuẩnSalmonella trên môi trường KIA, LIM, VP.
Sơ đồ 6: Quy trình phân lập vi khuẩnSalmonella 370C/24 giờ
370C/24 giờ
Kết luậnSalmonella TSA
Mẫu
Buffered Peptone Water (25ml)
Hajna Tetrathionate Broth (25ml)
MLCB BGA
BGA
370C/24 giờ
370C/24 giờ
KIA LIM VP
Bảng 3: Đặc tính sinh hóa của các chủngSalmonella (Elmer et al., 2001)
KIA LIM VP
Vi khuẩn
Glucose Lactose H2S Lysine Indole VP Di động
S. pullorum S. gallinarum S. arizonae S. enteritidis S. choleraesuis
S. typhimurium S. paratyphi
+ + + + + + +
- - - - - - -
- - + + + + +
+ + + + + + +
- - - - - - -
- - - - - - -
- - + + + + +
Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ không đạt với tổng vi khuẩn hiếu khí.
Tỷ lệ không đạt vớiE. coli.
Tỷ lệ không đạt vớiStap. aureus.
Tỷ lệ không đạt vớiSalmonella.