1.3. SỰ CẢM ỨNG SINH TỔNG HỢP ENZYM
1.3.4. Mô hình cảm ứng operon Lac
Dựa vào chức năng của các gen tham gia vào quá trình tổng hợp protein có thể phân thành các loại gen như sau:
+ Gen Promoter (P):
đứng trước gen operator, là vị trí liên kết RNA polymerase.
Promoter điều khiển việc nhận biết vị trí khởi đầu phiên mã của RNA polymerase. Ở vi khuẩn, hai trình tự consensus quan trọng trong promoter là TATAAT ( ở vị trí -10) và
TTGACA ( ở vị trí -35).
Hình 1.9: Cấu trúc của Operon Lac [66]
+ Gen điều hòa(i): gen này mã hóa cho một protein đặc biệt gọi là chất kìm hãm (repressor). Chất kìm hãm có vai trò “đóng mở” gen operator. Do đó, gen điều hòa có thể kiểm tra quá trình sao chép gen cấu trúc thông qua chất kìm hãm này.
Protein kìm hãm được tạo thành từ bốn chuỗi polypeptid (homotetramer).
Trên protein kìm hãm có hai vị trí liên kết: một gắn với một trình tự gồm 24 cặp base của operator trong operon Lac và một gắn với chất cảm ứng lactose. Protein kìm hãm gắn với DNA chủ yếu bằng liên kết tĩnh điện được tạo thành giữa các acid amin tích điện dương của protein (ví dụ; Lys, Arg, …) với khung sườn deoxyribose-phosphat tích điện âm của DNA.
+ Gen operator (O): Ở cạnh nhóm gen cấu trúc, đảm bảo cho quá trình sao mã các gen cấu trúc theo cơ chế ‘đóng mở” tựa công tắc của một dãy đèn. Quá trình sao chép chỉ có thể tiến hành khi gen
Promoter của gen điều hòa(Pi)
Gen điều hòa(i)
Promoter của gen cấu trúc(Plac )
Gen cấu trúc Operator
Operon Lac
operator ở trạng thái “mở” (không kết hợp với một chất nào cả) và ngừng lại khi nó bị đóng ( kết hợp với một chất đặc biệt gọi là chất kìm hãm).
Các gen cấu trúc cùng với gen operator tạo thành một đơn vị sao chép sơ cấp gọi là operon. Sự tổng hợp ARNm được bắt đầu ở một đầu của operon và chuyển qua gen cấu trúc đến đầu kia của operon.
+ Gen cấu trúc (S): Gen cấu trúc mã hóa enzym (hay protein) cần được tổng hợp. Các gen mã hóa các enzym được xắp xếp liền nhau thành một nhóm trên ADN. Chúng làm khuôn để tổng hợp phân tử ARN thông tin ( mARN) để từ đó tổng hợp nên phân tử protein tương ứng.
Trong operon Lac có ba gen cấu trúc:
Gen Z: Mã hóa cho enzym β-galactosidase (β-gal). Enzym này thủy phân lactose thành glucose và galactose. Khi được cảm ứng bằng lactose, số lượng enzym β-galactosidase tăng từ hầu như bằng không lên đến khoảng 2% trọng lượng của tế bào.[67],[68]
Gen Y: Mã hóa cho gen permease. Enzym này làm tăng tính thấm của màng tế bào với các β- galactosid. Permease vận chuyển lactose từ môi trường nuôi cấy qua màng tế bào chất để vào bên trong của tế bào. [67],[68]
Gen A: Mã hóa cho enzym transacetylase. Chức năng của enzym này chưa được hiểu rõ.
[67],[68]
+ CAP: là một trình tự gồm 16 cặp base nằm phía trước promoter, là vị trí mà protein CAP (catabolite activator protein) gắn với DNA. Protein CAP hay còn gọi là protein CRP(cAMP receptor protein) có khả năng hoạt hóa sự biểu hiện của operon Lac. Giống như chất kìm hãm, trên protein CAP có hai vị trí: một gắn với cAMP và một gắn với trình tự CAP trên ADN. Protein CAP chỉ có thể gắn với DNA khi ở trạng thái phức hợp với cAMP. Phức hợp này sẽ gắn vào một vùng nằm phía trước của vùng sẽ liên kết với RNA polymerase (promoter) và che phủ vị trí gắn của chất kìm hãm trên operator. Vì vậy, chất kìm hãm không gắn được vào trên operator, nên thúc đẩy sự phiên mã của RNA polymerase. Việc gắn phức hợp cAMP-CRP vào operon Lac kích thích hạt động của RNA polymerase lên gấp từ 20 đến 50 lần. [67],[68]
1.3.4.2. Sự cảm ứng operon Lac [11], [61], [68]
Sự cảm ứng bởi cơ chất ở operon Lac là một quá trình điều hòa phiên mã (điều hòa ở mức độ gen).
[61]
Năm 1961, Jacob và Monob đã đưa ra mô hình cảm ứng ở operon Lac gồm 5 bước như sau:
Bước 1: Gen điều hòa (gen i) mã hóa tạo ra protein kìm hãm có khả năng gắn vào operator và ức chế sự phiên mã của các gen cấu trúc.
Bước 2: Một chất cảm ứng có phân tử lượng nhỏ tạo ra phức hợp với chất kìm hãm và làm biến đổi chất kìm hãm.
Bước 3: Phức hợp chất cảm ứng-chất kìm hãm không gắn được vào operator.
Bước 4: Sự lỏng lẻo này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã các gen cấu trúc.
Bước 5: Trình tự RNA thông tin được dịch mã thành protein
Khi môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng
Trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng (lactose), gen điều hòa (gen i) tạo ra protein kìm hãm. Protein này được tổng hợp không có một sự điều chỉnh nào nhưng tồn tại một lượng không đáng kể (khoảng 10-20 phân tử trong tế bào). Protein kìm hãm có ái lực lớn với operator và gắn vào vùng operator của operon Lac, ngăn cản RNA polymerase phiên mã operon Lac. Vì vậy thông tin di truyền trên DNA không được sử dụng. [11]
Hình 1.10: Hoạt động của Operon Lac trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng[66]
Khi môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng
Khi có chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy, chất cảm ứng gắn vào protein kìm hãm và làm thay đổi hình dạng của protein này; vì vậy, nó không có khả năng gắn vào operator của operon. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho enzym RNA polymerase trượt trên operon và tiến hành quá trình phiên mã.
RNA thông tin được tạo ra trong quá trình phiên mã sẽ tạo ra các enzym β- galactosidase, permaese và transacetylase. [11]
Hình 1.11: Hoạt động của Operon Lac trong môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng[66]
Thực tế trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, khi môi trường có chứa glucose, chất ức chế operon Lac sẽ gắn vào vùng operator của operon Lac và ngăn cản sự phiên mã. Tuy nhiên, khi có chất cảm ứng của operon Lac (lactose, allolactose,…), chất cảm ứng này sẽ gắn với protein ức chế, vì vậy, nó không có
Protein kìm hãm Không có chất
cảm ứng
Lactose
Phiên mã
Có chất cảm ứng
khả năng tương tác với vùng operator của operon. RNA polymerase có thể gắn vào vùng promoter và tiến hành phiên mã operon đó. Khi môi trường có glucose, operon Lac vẫn bị kìm hãm mặc dù vẫn có chất cảm ứng lactose trong môi trường. Sự kìm hãm này duy trì cho đến khi nguồn glucose cạn kiệt. Sự kìm hãm operon Lac như trên gọi là sự kiềm hãm dị hóa. Sự kiềm hãm dị hóa là do mức độ cAMP thấp trong môi trường có nguồn glucose dồi dào. Vì vậy, nếu ta thêm cAMP vào môi trường giàu glucose thì sự kiềm hãm operon Lac sẽ được giảm đi. Khi lượng glucose trong môi trường giảm thì lượng cAMP sẽ tăng lên , đồng thời, làm tăng gắn chất cảm ứng vào protein kìm hãm Lac; Vì vậy làm tăng sự phiên mã của operon Lac. [68]