Sử dụng hai chủng Bacillus: Bs4 và Bl2 để tiến hành nuôi cấy trên môi trường bán rắn có bổ sung các cơ chất cảm ứng khác nhau, đo hoạt độ enzym pectinase, chọn cơ chất cảm ứng tốt nhất cho sự sinh tổng hợp pectinase.
3.3.1. Xác định hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy chủng hai Bacillus không có cơ chất cảm ứng và có cơ chất cảm ứng là pectin.
Chúng tôi sử dụng Citrus pectin của hãng JI-Degussa-Huls (Pháp) làm chất cảm ứng. Quá trình nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus là Bs4 và Bl2 được thực hiện trên môi trường bán rắn không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin theo mục 2.3.3 trong 48h, quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô.
Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.4 và đồ thị 3.1.
Bảng 3.4: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin
Mẫu Trọng lượng
giấy lọc(g) Trọng lượng giấy
lọc và kết tủa(g) Trọng lượng
kết tủa(g) Hàm lượng pectin(%)
1 0,8118 0,8389 0,0271 1,25
2 0,8124 0,8391 0,0267 1,23
3 0,8155 0,8423 0,0268 1,23
Hàm lượng pectin trung bình trong cà rốt(%) 1,24
Chủng Bacillus
Cơ chất cảm ứng
(%)
OD0
trung bình ODt
trung bình
OD
trung bình pectinase(UI/gCT) Hoạt độ
Không có 0,041 0,135 0,094 26,093
Pectin 1 0,048 0,339 0,291 80,870
Pectin 2 0,051 0,434 0,383 106,223
Pectin 3 0,053 0,518 0,465 129,170
Pectin 4 0,052 0,492 0,440 122,230
Bs4
Pectin 5 0,051 0,406 0,355 98,450
Không có 0,043 0,156 0,113 31,367
Pectin 1 0,051 0,324 0,273 75,688
Pectin 2 0,052 0,458 0,406 112,607
Pectin 3 0,054 0,584 0,530 147,120
Pectin 4 0,051 0,502 0,451 125,283
Bl2
Pectin 5 0,048 0,423 0,375 104,094
Đồ thị 3.1: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin.
Nhận xét:
Trong môi trường không có chất cảm ứng (môi trường bán rắn cơ bản), 2 chủng Bacillus vẫn có khả năng sinh tổng hợp enzym với hoạt độ là Bacillus licheniformic(Bl2): 31,367 (UI/g CT) và Bacillus subtilis(Bs4): 28,093 (UI/g CT).
Trong môi trường có chất cảm ứng là pectin, hoạt độ enzym pectinase của 2 chủng Bacillus: Bl2 và Bs4 tăng đáng kể. Điều này chứng tỏ enzym pectinase của 2 chủng Bacillus này là một enzym cảm ứng.
129,170 147,120
0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000
0% 1% 2% 3% 4% 5%
Lượng pectin bổ sung vào môi trường nuôi cấy(%)
Hoạt độ pectinase(UI/g CT)
Bs4 Bl2
Hoạt độ pectinase đạt cao nhất trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3% ở Bl2 là 147,120 (UI/g CT) (gấp 4,75 lần hoạt độ pectinase trong môi trường không có chất cảm ứng), ở Bs4 là 129,170(UI/g CT) (gấp 4,95 lần hoạt độ pectinase trong môi trường không có chất cảm ứng). Hoạt độ pectinase giảm dần khi môi trường có hàm lượng pectin 4% và 5%.
3.3.2. Xác định hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus có bổ sung nguyên liệu cảm ứng là cà rốt
Từ kết quả xác định hàm lượng pectin của cà rốt ở mục 3.2 chúng tôi điều chỉnh lượng cà rốt bổ sung vào môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ pectin là 3%, nuôi cấy các thời gian khác nhau theo mục 2.3.3, quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô.
Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.5 và đồ thị 3.2.
Bảng 3.5: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là cà rốt.
Chủng Bacillus
Thời gian nuôi cấy(h)
OD0
trung bình
ODt
trung bình OD trung bình
Hoạt độ pectinase(UI/g CT)
24 0.084 0,613 0.529 146.935
48 0.124 1,360 1.236 343.003
72 0.211 1,826 1.615 448.300
96 0.205 1,726 1.521 422.207
120 0.186 1,523 1.337 371.131
Bl2
144 0.129 1,212 1.083 300.532
24 0.072 0,512 0.440 122.137
48 0.127 1,326 1.199 332.732
72 0.164 1,484 1.320 366.320
96 0.201 1,712 1.511 419.523
120 0.185 1,655 1.470 408.142
Bs4
144 0.146 1,322 1.176 326.533
Đồ thị 3.2: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là cà rốt.
Nhận xét:
Ở chủng Bl2, hoạt độ tăng nhanh đáng kể từ sau 24 h nuôi cấy và đạt cực đại tại 72h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 448,022 (UI/g CT). Gấp 14,3 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng, gấp 3,05 lần trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3%.
Ở chủng Bs4, hoạt độ pectinase đạt cực đại tại 96h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 419,523 (UI/g CT).
Gấp 15,58 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng, gấp 3,25 lần trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3%.
3.3.3. Xác định hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus có bổ sung nguyên liệu cảm ứng là vỏ bưởi
Từ kết quả xác định hàm lượng pectin của vỏ bưởi ở mục 3.2 chúng tôi điều chỉnh lượng vỏ bưởi bổ sung vào môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ pectin là 3%, nuôi cấy các thời gian khác nhau theo mục 2.3.3, quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô.
Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.6 và đồ thị 3.3.
Bảng 3.6: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là vỏ bưởi
Chủng Bacillus
Thời gian nuôi cấy(h)
OD0
trung bình
ODt
trung bình OD trung bình
Hoạt độ pectinase(UI/g CT)
Bl2 24 0,061 0,253 0,192 53,204
448,022 419,523
0 100 200 300 400 500
24h 48h 72h 96h 120h 144h Thời gian nuôi cấy(h)
Hoạt độ enzim pectinase(UI/g CT)
Bl2 Bs4
205,043 182,929
0 50 100 150 200 250
24h 48h 72h 96h 120h 144h Thời gian nuôi cấy(h)
Hoạt độ enzim pectinase(UI/g CT)
Bl2 Bs4
48 0,068 0,543 0,475 131,945
72 0,071 0,597 0,526 145,917
96 0,075 0,814 0,739 205,043
120 0,062 0,687 0,625 173,491 144 0,065 0,603 0,538 149,433
24 0,059 0,156 0,097 27,018
48 0,063 0,324 0,261 72,357
72 0,066 0,652 0,586 162,757
96 0,071 0,703 0,632 175,341
120 0,074 0,733 0,659 182,929 Bs4
144 0,069 0,702 0,633 175,804
Đồ thị 3.3: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là vỏ bưởi
Nhận xét:
Đối với chủng Bl2, sau 24h hoạt độ pectinase tăng nhanh và đạt cực đại tại 96h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 205,043 UI/g CT ( gấp 6,5 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng, gấp 1,39 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3%, tuy nhiên thấp hơn 2,19 lần so với môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng là cà rốt).
Đối với chủng Bs4, hoạt độ pectinase đạt cực đại tại 120h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 182,929 UI/g CT (gấp 7,01 lần so với môi trường không có chất cảm ứng, gấp 1,42 lần so với môi trường có chất cảm ứng là pectin 3%, tuy nhiên thấp hơn 2,29 lần so với môi trường có chất cảm ứng là cà rốt).
Như vậy, trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất cảm ứng vỏ bưởi thì thời gian nuôi cấy để hoạt độ enzym pectinase đạt giá trị cực đại dài hơn (dài hơn 24h) và giá trị hoạt độ enzym pectinase cực đại thấp hơn so với trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất cảm ứng là cà rốt (do cà rốt ngoài cung cấp
nguồn cacbon còn rất giàu các chất dinh dưỡng khác như vitamin, khoáng chất và axit amin). Vì vậy chúng tôi quyết định chọn cà rốt là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp pectinase của hai chủng Bs4
và Bl2.