2.1 Nội dung nghiên cứu
Đánh giá khả năng phòng, trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới trên cà chua.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023.
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bệnh cây Bộ môn Bảo vệ Thực
vật và nhà lưới trại thực nghiệm khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
2.3 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu thí nghiệm
Bảng 2.1 Danh sách các khuẩn được sử dung trong nghiên cứu
STT Ki hiệu Định danh sơ bộ
1 CXT3 Ralstonia solanacearum
2 ĐXTI Klebsiella pneumoniae
3 CC-LD 2.2 Actinobacteria
4 DXT6 Bacillus amyloliquefaciens
5 ĐHTI Enterobacteriaceae
Các vi khuân được cung cấp tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật. Các chủng ĐXTI, CC-LĐ2.2, DXT6, ĐHTI có kha năng đối kháng cao với vi khuan Ralstonia solanacearum trong 6 dong vi khuẩn được sử dung trong dé tài của Đặng Thị
Huỳnh Như (2022).
Hình 2.1 Vi khuân Ralstonia solanacearum chủng CXT3 (A), Klebsiella pneumoniae
chúng DXT1 (B), Actinobacteria chung CC-LÐ2.2 (C), Bacillus amyloliquefaciens chủng DXT6 (D), Enterobacteriaceae chủng DHT1 (E).
Hat giống cà chua F1 (PN-209) tai cơ sở hạt giống Phú Nông.
2.3.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Dụng cụ: Đĩa petri (15 x 90 mm, Trung Quốc), nước cất khử trùng, que cấy, vải lọc, bình tam giác thủy tinh (250ml), thước do, pipet (GLISON, FRANCE), đèn côn.
Thiết bị: Tủ cấy khử trùng (IIA2 — 4E8, Esco, Singapore), nồi hấp khử trùng (MC40L, ALP, Japan), máy say khử trùng (IN10, Memmert, German), cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện, máy lắc (SSL1, Stuart, Anh), máy lắc Vortex- ZX3 (Velp, Y), máy NanoVueTM Plus (SCIE-PLAS LTD, Boichrom, Anh), kính hién vi
(CX23, Olympus, Japan).
2.3.3 Hóa chat và thành phan môi trường
Hóa chất: cồn 70%, cồn 96%, agar, peptone (Trung Quốc), glycerol (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), cao nắm men (Việt Nam).
Thành phần môi trường:
Môi trường LB - Luria Broth: thành phan 1 lít peptone 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước 1000ml. Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường WA — Water agar: thành phan Agar 20 g, nước cất 1000 ml.
2.4 Phuong pháp nghiên cứu
2.4.1 Đánh giá kha năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn
Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm
Sử dụng kết hợp 4 dòng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum dé đánh giá khả năng phòng trừ với vi khuân Ralstonia solanacearum trên cà chua trong
phòng thí nghiệm.
Chuẩn bị: Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây. Ủ hạt trên giấy thâm vô trùng được làm âm đặt trong dia petri, giữ ở nhiệt độ phòng 27 - 30°C.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn đối kháng được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc khuẩn trên máy lắc, thời gian thích hợp với từng loại khuẩn nuôi cấy dé đạt mật độ 105 CFU/ml.
Dich vi khuẩn héo xanh: Nuôi vi khuẩn CXT3 trong môi trường LB lỏng, lắc khuẩn trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ, pha loãng trong nước cất vô trùng dé đạt mật
độ 10° CFU/ml.
Bồ trí thí nghiệm: gồm 2 thi nghiệm, mỗi thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngau nhiên đơn yếu tô, với 14 nghiệm thức trong đó có 3 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức là 1 đĩa petri, mỗi đĩa 10 hạt cà chua, 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm 1a: Đánh giá khả năng phòng bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm.
- NTI: xử lý ĐXTI + DXT6 va CXT3 - NT2: xử lý ĐXTI + ĐHTI và CXT3 - NT3: xử lý ĐXTI +CC-LĐ 2.2 và CXT3 - NT4: xử lý DXT6 + ĐHTI và CXT3 - NTS: xử lý DXT6 + CC-LD 2.2 và CXT3 - NT6: xử lý DHT1 +CC-LĐ 2.2 và CXT3 - NT7: xử lý ĐXTI + ĐXT6 + ĐHTI và CXT3 - NT8: xử lý ĐXTI + DXT6 + CC-LD 2.2 và CXT3
- NT9: xử lý ĐXTI + DHT1 + CC-LD 2.2 và CXT3 - NT10: xử lý DXT6 + ĐHTI + CC-LĐ 2.2 và CXT3
- _ NTI1: xử lý kết hợp 4 khuẩn DXT1 + DXT6 + DHT1 + CC-LĐ 2.2 và CXT3 - NT12: xử lý vi khuẩn bệnh CXT3 (DCB)
- NTI3: xử lý nước cất (ĐCKB)
- NT14: xử lý với vi khuan đối kháng (DCDK)
Thí nghiệm 1b: Đánh giá khả năng trừ bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm.
- NTI: xử ly CXT3 và ĐXTI + DXT6 - NT2: xử ly CXT3 va ĐXTI + ĐHTI - NT3: xử lý CXT3 va DXT1 + CC-LD 2.2 - NT4: xử ly CXT3 va DXT6 + ĐHTI - NT5: xử lý CXT3 và DXT6 + CC-LD 2.2 - NT6: xử lý CXT3 và ĐHTI + CC-LD 2.2 - NT7: xử ly CXT3 va ĐXTI + DXT6+ ĐHTI - NT8: xử lý CXT3 và DXT1 + DXT6 + CC-LD 2.2 - NT9: xử ly CXT3 va DXT1 + DHT1 + CC-LD 2.2 - NT10: xử lý CXT3 va DXT6 + DHT1 + CC-LD 2.2
- _ NTI1: xử ly CXT3 và kết hợp 4 khuân DXT1 + DXT6 + DHT1 + CC-LD 2.2 - NT12: xử lý vi khuẩn bệnh CXT3 (DCB)
- NT13: xử lý nước cất (ĐCKB)
- NT14: xử lý với vi khuẩn đối kháng (ĐCĐÐK)
Phương pháp thực hiện: Theo phương pháp Silva va ctv (2003), có cải tiến.
Thí nghiệm 1a phòng bệnh: Khi hạt nay mam khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào dịch vi khuân đối kháng đã chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thâm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuân bệnh CXT3 trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, cấy vào dia petri chứa sẵn môi trường WA (10 hạt trên một đĩa petri), dùng giấy bạc bọc một nửa đĩa petri để ngăn ánh sáng chiếu vào rễ và đặt nghiêng một
góc 609, đặt ở nhiệt độ phòng.
Thí nghiệm 1b trừ bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 — 2 mm, ngâm hạt vào dich vi khuẩn bệnh CXT3 đã chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô
trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuân đối kháng trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, cay vào dia petri chứa sẵn môi trường WA (10 hạt trên một đĩa petri), dùng giấy bạc bọc một nửa đĩa petri để ngăn ánh sáng chiếu vào rễ và đặt nghiêng
một góc 60°, đặt ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo đõi: Ở thời điểm 7 ngày sau khi đặt vào đĩa petri.
Chiều dài thân (mm): đo từ gốc đến ngọn. Chiều dài rễ (mm): đo từ gốc cho đến đỉnh rễ dài nhất. Khối lượng tươi (mg): cân khối lượng tất cả các cây trong chậu. Khối lượng khô (mg): cân khối lượng khô của cây sau khi sấy ở 70°C đến khi đạt trọng lượng không đồi.
Ty lệ bệnh (%)
TLB (%) = (Số cây bị bệnh/ Tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức) x 100 2.4.2 Đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong điều kiện nhà lưới
Thí nghiệm được bố trí theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 714:2006 có cải tiến.
Sử dụng kết hợp 4 dòng vi khuẩn đối kháng dé đánh giá khả năng phòng trừ với vi khuan Ralstonia solanacearum trên cà chua trong điều kiện nhà lưới.
Chuẩn bị: chuẩn bị giá thé bao gồm đất, xơ dừa, phân hữu cơ theo tỷ lệ 2:1:1, sau đó cho vào chậu có đường kính 20 cm, tưới am. Hat giống sử dụng là hạt sạch, hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây. Ủ hạt trên giấy thấm vô trùng được làm ầm đặt trong dia petri, giữ ở nhiệt độ phòng 27 - 30°C.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn
Dịch vi khuẩn héo xanh: Nuôi vi khuẩn CXT3 trong môi trường LB lỏng ở nhiệt độ phòng, lắc khuân trên máy lắc. Sau 48 giờ, pha loãng trong nước cat vô trùng dé dat
mật độ 10” CFU/ml.
Dịch vi khuẩn đối kháng: Vi sinh vật đối kháng được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc khuẩn trên máy lắc cho đến khi đạt mật số 107 CFU/ml.
Bồ trí thí nghiệm: gồm 2 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được bồ trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, với 14 nghiệm thức trong đó có 3 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức là 10 chậu, mỗi chậu 5 cây cà chua, 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm 2a: Đánh giá khả năng phòng bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi
R + A ` 2 oA oan ` re
khuân Ralstonia solanacearum trên cà chua ở điều kiện nhà lưới NTI
NT2:
NT3:
NT4:
NTS:
NT6:
NT7:
NT8:
NT9
: xử ly DXT1 + DXT6 va CXT3 xử ly DXT1 + DHT1 va CXT3 xử ly ĐXTI + CC-LD 2.2 và CXT3 xử ly DXT6 + ĐHTI và CXT3 xử lý DXT6 + CC-LD 2.2 và CXT3 xử lý DHT1 + CC-LD 2.2 và CXT3 xử lý ĐXTI + DXT6 + ĐHTI và CXT3 xử lý DXT1 + DXT6 + CC-LD 2.2 và CXT3 : xử ly DXT1 + DHT1 + CC-LD 2.2 và CXT3 NT10: xử ly DXT6 + DHT1 + CC-LD 2.2 và CXT3
NTI 1: xử lý kết hop 4 khuẩn DXT1 + DXT6 + DHT1 + CC-LĐ 2.2 và CXT3 NT12: xử lý vi khuẩn bệnh CXT3 (DCB)
NTI3: xử lý nước cất (DCKB)
NT14: xử lý với vi khuẩn đối kháng (DCDK)
Thí nghiệm 2b: Đánh giá khả năng trừ bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi
khuân Ralstonia solanacearum trên cà chua ở điêu kiện nhà lưới
NT1 NT2:
NT3:
NT4:
NTS:
NT6:
NT7:
NT8:
NT9:
: xử ly CXT3 va DXT1 + DXT6 xử ly CXT3 va DXT1 + ĐHTI xu ly CXT3 va DXT1 + CC-LD 2.2 xử lý CXT3 va DXT6 + DHT1 xu ly CXT3 va DXT6 + CC-LD 2.2 xu ly CXT3 va DHT1 + CC-LD 2.2 xử ly CXT3 va DXT1 + DXT6 + ĐHTI xu ly CXT3 va DXT1 + DXT6 + CC-LD 2.2 xử ly CXT3 và DXT1 + DHT1 + CC-LD 2.2
- NT10: xử lý CXT3 và DXT6 + DHT1 + CC-LD 2.2
- _ NTI1: xử lý CXT3 và kết hợp 4 khuẩn DXT1 + DXT6 + DHT1 + CC-LD 2.2 - NT12: xử lý vi khuẩn bệnh CXT3 (DCB)
- NTI13: xử lý nước cất (ĐCKB)
- NT14: xử lý với vi khuẩn đối kháng (DCDK) Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được bồ trí theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 714:2006 có cải tiến.
Thí nghiệm 2a phòng bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 - 2 mm, ngâm hạt vào dịch vi khuẩn đối kháng (107 CFU/ml) đã chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuẩn bệnh Ralstonia solanacearum chủng CXT3 (107 CFU/ml) trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thấm vô trùng, mang hạt trồng vào chậu, 5 hat/1 chậu.
Thí nghiệm 2b trừ bệnh: Khi hạt nảy mầm khoảng 0,5 - 2 mm, ngâm hạt vào dich vi khuẩn bệnh Ralstonia solanacearum chủng CXT3 (107 CFU/ml) đã chuẩn bị trong 30 phút. Vớt hạt làm khô trên giấy thấm vô trùng, tiếp tục ngâm hạt vào vi khuẩn đối kháng (107 CFU/ml ) trong 30 phút. Vớt hạt làm khô nhanh trên giấy thắm vô trùng, mang hạt trồng vào chau, 5 hạt/1 chậu.
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi hàng ngày tiến hành lấy chỉ tiêu tại thời điểm khi bệnh bắt đầu xuất hiện đến khi nghiệm thức xử lý vi khuẩn bệnh bị nhiễm bệnh 80%, mỗi lần đo cách nhau 7 ngày, lay chỉ tiêu 3 lần lặp lại mỗi LLL đo 6 chậu mỗi chậu 5 cây
cà chua.
Chiều dai thân (cm): do từ gốc đến ngọn. Chiều dài rễ (cm): đo từ gốc cho đến đỉnh rễ dài nhất. Khối lượng tươi (g): cân khối lượng tat cả các cây trong chậu. Khối lượng khô (g): cân cây sau khi say ở 70°C đến khi đạt trọng lượng không đổi.
Đếm tổng số cây bị nhiễm bệnh trên ô thí nghiệm, quan sát sự nhiễm bệnh và phân cấp bệnh được ghi nhận sau đó tính tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%) theo thang đánh giá của Ateka va ctv (2001). Phân cấp bệnh: Cấp 0: không bệnh; Cấp 1: có 1 - 10% lá héo;
Cấp 2: 11 - 30% lá héo; Cấp 3: 31 - 60% lá héo; Cấp 4: > 60% lá héo; Cấp 5: tat ca các lá đều héo.
Tỷ lệ bệnh (%)
TLB (%) = (Số cây bị bệnh/ Tổng số cây lây nhiễm của nghiệm thức) x 100 Chỉ số bệnh (%)
CSB(%) = [(Snst+4nz+3ns+2nz+n¡)/SN]|x100
Trong đó:
ns: số cây nhiễm bệnh cấp 5 n4: số cây nhiễm bệnh cấp 4 na. số cây nhiễm bệnh cấp 3 no: số cây nhiễm bệnh cấp 2 ni: số cây nhiễm bệnh cấp 1 N: tông số cây điều tra
Chỉ số diện tích bên dưới đường cong tiến triển bệnh AUDPC (Area Under Disease
Progressive Curve) được tính theo công thức sau (Jeger and Viljanen — Rollinson, 2001)
T1
AUDPC =) 0,5[Œi, + Y)] x (ties — t)
t=1
Trong đó, i: lần theo dõi bệnh thứ i; n: tông số lần theo déi bệnh; Y: chi số bệnh; t: số
ngày đánh giá bệnh.
Hiệu lực phòng trừ được tính theo công thức Abbot (1925), như sau:
HLPT (%) = [(C-T)/C)] x 100
Trong đó:
C: là chỉ số bệnh ở công thức đối chứng (chỉ ngâm khuẩn bệnh).
T: số chỉ số bệnh héo xanh ở công thức thí nghiệm.
2.5 Xử lý số liệu
Các số liệu được tông hop, tính toán bang phần mềm Microsoft Office Excel 2016.
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng Ducan sử dụng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3