2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2023 đến tháng 08/2023 tại phòng Vi sinh
Nông nghiệp (RIBE 208) thuộc Khoa Khoa học Sinh học Trường Dai học Nông Lam
Thành phố Hồ Chí Minh và ngoài đồng tại Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ và thiết bị:
Dụng cụ phòng thí nghiệm: Bình tia nước, ống đong, cốc đong, đĩa petri, ray lọc đường kính lỗ ray 500 pm — 85 um — 40 um, ống falcon, lam kính, lamen, micropIpet, đĩa đếm AM, đĩa đếm tuyến trùng 3ml, thước đo, kéo, lưỡi dao lam, giấy lọc, bút lông, giấy bạc, khẩu trang...
Dụng cụ nhà lưới: kéo, dao, chậu nhựa, khay nhựa ươm hạt, đĩa nhựa lót chậu,
khẩu trang, thước đo...
Dụng cụ đồng ruộng: chậu nhựa, màng phủ sinh học, khay ươm hạt, bình phun thuốc, bọc nilong, khẩu trang, thước đo...
Thiết bị: Kính hiển vi, kính soi nổi, máy ly tâm, bếp đun, máy khấy từ, cân điện
tử, tủ mát.
Gia thé trồng cây nhà lưới: đất trồng trộn với sơ dừa, phân hữu cơ, dat tribat.
Hóa chất: Côn, nước cất, hóa chất dùng trong phân lập, nhuộm rễ, nhuộm tuyến
trùng: Glycerol, sucrose Tryphan blue, KOH, HCl.
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.1. Khao sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne gây nên bệnh trên cây cà chua của chế phẩm sinh học (AM) trong điều kiện nhà lưới.
Chuẩn bị chậu nhựa có kích thước 25 x 20 x 20 cm, mỗi chậu chứa khoảng 4 —5
kg đất sạch. Hạt giống ca chua được ươm trong khay ươm, đến khi cây phát triển 4 — 5 lá sau khoảng 15 — 20 ngày tuổi, chuyển cây vào chậu nhựa đã chuẩn bị sẵn trong nhà
lưới.
Bồ tri thí nghiệm theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tô với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại có 5 nghiệm thức. Mỗi NT gồm 30 chậu. Mật số bào tử AM có trong chế phẩm 106 bào tử/kg chế phẩm, gồm có 2 chỉ: chi Glomus và chi Acaulospora.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong nhà lưới:
LLI LL2 LL3
NII NT3 NT5
NT2 NT5 NT3
NT3 NT2 NT4
NT4 NHI NT2
NT5 NT4 NT1
Chiều biến thiên độ dốc của thí nghiệm
NT1: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) va không dùng AM (BC+).
NT2: Mẫu không chủng tuyến trùng và không dùng AM (DC-).
NT3: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) va sử dung AM 6 mức liều lượng 2,5g/kg giá thể.
NT4: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) và sử dụng AM ở mức liều lượng 5g/kg giá thể.
NTS5: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) và sử dụng AM ở mức liều lượng 10g/kg giá thê.
Quy mô thì nghiệm: Tổng số cây thí nghiệm nhà lưới là 30 cây/NT x 3LLL x SNT =
450 cây (6 thí nghiệm 30m’).
Thời gian xử lý chế phẩm sinh học:
Lần 1: Khi trộn đất và ra cây thí nghiệm.
Lần 2: Sau 15 ngày xử lý lần 1.
Thời gian lây nhiễm tuyến trùng: Sau 10 ngày xử lí chế phẩm sinh học lần 1.
Thời gian theo đõi: 7, 14, 21, 28 ngay sau khi chủng bệnh (NSC).
Chỉ tiêu theo dõi:
Chỉ tiêu nông học: Quan sát, đo kích thước chiều cao của cây và chiều dài bộ rễ (cm), đếm số lượng lá va số lượng rễ, cân trực tiếp sinh khối bộ rễ tươi (8).
Chỉ tiêu tuyến trùng: mật số tuyến trùng trong đất (50 g đất) và trong rễ (2 -5 g rễ) Chỉ tiêu về nắm nội cộng sinh (AM): mật số bào tử nắm AM (100 g đất); tỷ lệ cộng sinh của nam AM (trên 100 đọan rễ quan sát).
Hiệu lực thuốc (%): Hiệu lực thuốc được tính theo công thức Henderson-Tilton
E(%)= [1-(Ta x Cb)/(Tb x Ca)] x 100
Trong đó:
E: Hiệu lực khảo nghiệm.
Ta: Mật độ tuyến trùng ở công thức xử thuốc tại thời điểm sau xử lý.
Tb: Mật độ tuyến trùng ở công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý.
Ca: Mật độ tuyến trùng ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý.
Cb: Mật độ tuyến trùng ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lí.
2.2.1.2. Đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne spp. gây bệnh
trên cay cà chua của chê pham sinh học AM ở điêu kiện dong ruộng
Từ kết quả của nội dung thí nghiệm trong nhà lưới tiến hành bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng. Bồ tri thí nghiệm theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 4 NT. Mỗi NT được bố trí 2 lip, mỗi lip 40 chậu (80 chậu/ NT). Tổng số cây thí nghiệm: 80 cây/NT x 3LLL x 4NT = 960 cây.
Bồ sung chế pham sinh học 2 lần, lần 1 được bón ngay khi trồng cây, lần 2 cách lần đầu 15 ngày. Dựa vào kết quả khảo sát của nội dung 1, chọn ra liều lượng có kết quả tốt nhất dé tiến hành bổ sung chế phâm kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm đơn yếu tổ được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm
4 nghiệm thức, 3 LLL.
Sơ đồ bó trí thí nghiệm đồng ruộng:
LLL1 LLL2 LLL3
NT2 | NT3 | NT4 | NTI | NT3 | NT1 | NT4 | NT2 | NT4 | NT3 | NT1 | NT2
Chiêu biên thiên độ dôc của vườn thí nghiệm
NT1: Sử dụng sản phẩm vi sinh thị trường của Viện Thổ nhưỡng nông hóa với liều lượng theo khuyến cáo nha sản xuất.
NT2: Sử dụng sản pham hóa học VELUMprime 400SC với mức liều lượng phuntheo khuyến cáo nhà sản xuất.
NT3: Sử dụng chế pham AM (kế thừa Nội dung 1, b6 sung 10g/kg giá thé).
NT4: Đối chứng (DC-)
Quy mô thí nghiệm
Tổng số cây thí nghiệm đồng ruộng là 40 cây/NT x 3LLL x 4NT = 480 cây (ô thí nghiệm
30m’).
Thời gian theo doi: 1ONXL Lan 1, TXL Lần 2, 1ONXL Lần 2, 20 NXL Lần 2.
Thời gian xử ly chế phẩm sinh học:
Lần 1: Khi trộn đất và ra cây thí nghiệm.
Lần 2: Sau 15 ngày xử lý lần 1.
Chỉ tiêu theo dõi:
Chỉ tiêu nông học: Quan sát, đo kích thước chiều cao của cây và chiều dài bộ rễ (cm),dém số lượng lá và sỐ lượng rễ, cân trực tiếp sinh khối bộ rễ tươi (g).
Chi tiêu tuyến trùng: mật số tuyến trùng trong dat (50 g dat) va trong rễ (2 -5 g rễ) Chỉ tiêu về nắm nội cộng sinh (AM): mật số bào tử nam AM (100 g dat); tỷ lệ cộng sinh của nấm AM (trên 100 đọan rễ quan sát).
Hiệu lực thuốc (%): Hiệu lực thuốc được tính theo công thức Henderson-Tilton
E(%)= [1-(Ta x Cb)/(Tb x Ca)] x 100
Trong đó:
E: Hiệu lực khảo nghiệm.
Ta: Mật độ tuyến trùng ở công thức xử thuốc tại thời điểm sau xử lý.
Tb: Mật độ tuyến trùng ở công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý.
Ca: Mật độ tuyến trùng ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý.
Cb: Mật độ tuyến trùng ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lí.
2.2.2. Cách thu chỉ tiêu
Cách thu chỉ tiêu: chon cây cà chua dé thu mẫu cây và đất > nghiêng nhẹ chậu và lăn nhẹ dé phan chậu tách khỏi dat trong chậu > thu phan đất rớt ra từ bộ rễ (khoảng 400 g đất) > đem cây cà chua ngâm vào nước dé phan đất còn lại trên bộ rễ mềm đi và rơi ra (hạn chế làm đứt rễ) > thu cả cây và bộ rễ.
Cách đo, đếm các chỉ tiêu theo dõi:
Chiều cao cây: Do từ cô rễ đến đỉnh sinh trưởng.
Chiều dài rễ: Vuốt thắng bộ rễ sau đó đo từ cô rễ đến đầu đoạn rễ dài nhất.
Số lá: Đếm phần cuống lá, không đếm đỉnh sinh trưởng (Đối với lá rụng, ta đếm phần sẹo cuống trên thân).
Số rễ: Cắt rễ cấp 1 ra khỏi bộ rễ và đếm số lượng rễ cấp 1.
Trọng lượng rễ: Sau khi đếm sé rễ, ta đem tất cả rễ được cắt ra với Cân điện tử.
Tỉ lệ rễ bệnh: Đếm số rễ bị u sưng và tính tỉ lệ trên tông số rễ được điều tra.
Mật số tuyến trùng trong đất: Sau khi tách — lọc tuyến trùng theo phương pháp chuẩn
ta tiên hành đêm mật sô trên kính hiên vi.
Mật số tuyến trùng trong rễ: Sau khi nhuộm rễ tuyến trùng thao phương pháp chuân thu được các đoạn rễ, tiến hành gắp 100 đoạn rễ đặt lên kính hiển vi quan sát và đếm mật số.
Bào tử trong đất: Sau khi ly tâm thu được dịch chứa bào tử ta tiến hành đếm mật số
trên kính soi nôi hoặc kính hiên vi.
Cộng sinh trong rễ: Sau khi nhuộm rễ theo phương pháp chuẩn ta tiến hành gắp 100 đoạn rễ nhỏ đặt lên kính hiển vi quan sát và đếm bào tử cộng sinh trong rễ.
2.2.3. Theo dõi mật số tuyến trùng
Thời gian theo dõi: 7, 14, 21, 28 ngày sau khi chủng bệnh (Kế thừa dé tài “Nghiên cứu sản xuất nắm nội công sinh (Arbucular Mycorrhiza — AM) nhằm kiểm soát tuyến trùng và một số nắm bệnh hại trên rau tại TP. Hồ Chí Minh”). (TS. Trương Phước Thiên
Hoàng)
Phương pháp tách — lọc tuyến trùng từ đất: gồm 5 bước
Bước 1: Đặt một rây lọc (kích thước lỗ 85 um) lên đĩa petri, trên ray lọc lót mộtkhăn giấy thấm.
Bước 2: Cân 50 g đất chứa tuyến trùng lên khăn giấy.
Bước 3: đồ nước làm 4m đều phan đất, sao cho phần nước vừa chạm váo mặt ray.
Bước 4: Sau 24 - 48 giờ thu phan dịch chứa tuyến trùng lắng xuống đáy đĩa và đưa vào đĩa đêm tuyến trùng chuyên dung
Bước 5: Kiểm tra và quan sát dưới kính hién vi để xác định tuyến trùng nội sinh hoặc
hoại sinh.
Phương pháp đếm mật số tuyến trùng:
Dan đều dịch tuyến trùng thu được sau 24 — 48 giờ trên đĩa đếm tuyến trùng chia ô, xem kính hiển vi quang hoc vật kính 10%. Lắc nhẹ sao cho dịch tuyến trùng đàn đều bề mặt đĩa đếm 406 ô vuông, có thể đếm toàn bộ các ô hoặc đếm các ô đại diện (20 ô), tính trung bình mật số hiện diện trên 1 6 và nhân với tổng số ô trên đĩa, được tính bằng
công thức sau:
N XVisng x 406 Vaém x 20 Mật số ký sinh =
Trong đó:
N: Số lượng tuyến trùng ký sinh đếm được.
Viêng: Thẻ tích dịch chiếc thu được.
Vaém: Thể tích dịch chiếc dan trai trên đĩa đếm.
406: Số ô hiện diện trên đĩa đếm.
20: Số ô đếm cho mẫu dịch chiếc.
Nhận diện tuyến trùng trong mô thực vật
Phương pháp nhuộm tuyến trùng trong mô thực vật dựa theo hướng dẫn của Bybd và ctv (1983) có cải tiến. Phương pháp dùng để quan sát các quá trình sinh trưởng của Meloidogyne bên trong mô rễ bị nhiễm bệnh. Chuẩn bị thuốc nhuộm để phục vụ việc nhuộm mô bao gồm: dung dịch Lactoglycerol (Acid lactic : Glycerol : Nước cất theo ti Tệ1 : 1z 1 bỗ sung Acid Fushin 0,5%. Mô thực vật chứa ký sinh được rửa nhẹ để loại bỏ đất cát, sau đó cắt thành những đoạn rễ nhỏ chiều dài khoảng 1 cm, ngâm trong dung
dich NaCIO 1% (được pha loãng từ dung dịch Javen 5%) từ 3 — 5 phút và rửa lại với
nước. Cho mẫu đã rửa sạch vào ống falcon chứa thuốc nhuộm đun sôi trong 3 — 5 phút và dé nguội, rửa sạch với nước. Cudi cùng ngâm rễ trong dung dich Acid Lactic : Acid Acetic : Nước cất có tỉ lệ 1:1:1.
Tuyến trùng ký sinh và túi trứng trong mô rễ thực vật sẽ bắt màu thuốc nhuộm (màu hồng), mô thực vật hầu như trong suốt. Quan sát mẫu nhuộm dưới kính hiền vi.
2.2.4. Khảo sát khả năng hạn chế tuyến trùng Meloidogyne spp. gây bệnh cây trồng của
chê phâm sinh học nâm nội cộng sinh Mycorrhiza
Chuẩn bị chậu nhựa có kích thước 25 x 20 x 20 em. Mỗi chậu chứa khoảng 4 — 5 kg đất sạch đã hap xử lý. Hạt ca chua được ươm trồng trong khay nhựa, đến khi cây phát triển 4 — 5 lá mầm sau khoảng 7 — 15 ngày tuổi, chuyên sang chậu nhựa trong nhà lưới và sẽ được bổ sung 30 g chế pham sinh học nam cộng sinh Mycorrhiza (ở 5 mức tỉ lệ 30%, 40%, 50%, 60%, 70% AM và chế phâm thương mại AM thị trường) 10 ngày trước khi lây nhiễm bệnh. Lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng cách xới nhẹ lớp đất mặt trên mỗi chậu, tưới dịch tuyến trùng được đếm ước lượng khoảng 1000 con/5 kg dat/chau. và duy
trì dinh dưỡng và chăm sóc cây.
Bồ trí thí nghiệm theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên (Randomized Complete Block Design — RCBD), đơn yếu tô với 3 lần lặp lại trên mỗi 8 nghiệm thức, Trong đó, có 1 nghiệm thức đối chứng dương không được xử lý với sản phẩm sinh học, 1 nghiệm thức đối chứng âm không được lây nhiễm tuyến trùng và xử lý sản phẩm sinh học, 5 nghiệm thức xử lý với sản phẩm sinh học thử nghiệm và 1 nghiệm thức xử lý với sản phẩm thương mại thị trường. Mỗi nghiệm thức tương ứng với 10 chậu, lặp lại 3 lần, tổng số chậu thí nghiệm là 240 chậu. Thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới Viện Nghiên
cứu Công Nghệ Sinh học và Môi trường, Đại hoc Nông Lâm TP.HCM với các công
thức được thê hiện bên dưới.
Tiến hành đánh giá và ghi nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 7, 14, 21, 28 ngày sau
khi lây nhiễm nguồn bệnh lên rễ cây.
[a er 4/7 J^ eK F$ A . ^ Ẩ
Đánh gia tỉ lệ nhiễm nam cộng sinh trên rễ
Mẫu rễ sau khi được rửa sạch dưới vòi nước đề tiễn hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips và Hayman (1970) có cải tiến. Cắt những đoạn rễ dai 1 cm và xử lý bằng dung dịch KOH 10% đun nhiệt độ 80°C, 30 — 40 phút. Ngâm trong HCI 2% trong 15 phút để trung hoà, sau đó rửa mẫu bằng nước cất. Rễ được nhuộm với thuốc nhuộm Trypan Blue 0,05% (theo công thức Acid Lactic : Glycerol : Nước cất tỉ lệ 1 :1 : 1 bổ sung 0,05% Trypan Blue) trong 20 phút ở 80°C. Quan sát đưới kính hién vi dé xác định
sự hiện diện nam cộng sinh và tính ti cộng sinh của nam ré.
Đánh giá mật sô của bào tử AM trong đât
Thu bao tử nam cộng sinh từ đất theo kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết hợp với
phương pháp ly tâm trong dung dịch sucrose 50% (Theo phương pháp của Brundrett, 1996, có chỉnh sửa):
Bước 1: Cân 50 g đất, loại bỏ các tạp chất thô như đá to hoặc rác trong mẫu dat, sau đó cho vào cốc 500 ml nước cat, khuấy đều trong 30 phút dé hòa tan các hạt đất.
Bước 2: Khuấy đều dung dịch dat và dé yên khoảng 1 phút cho các thành phan đất đá lắng xuống dưới, sau đó lọc dung dịch đất qua các rây có kích thước lỗ rây lần lượt là 500 um và 40 tim, rửa dưới vòi nước cho đến khi nước đi qua ray không còn màu đục. Bào tử nam sẽ được giữ lại trên ray lọc có kích thước lỗ 40 um.
Bước 3: Thu phan chat rắn trên sàng 40 um cho vào khoảng 1/3 ống falcon thé tích 50 ml, sau đó thêm 2/3 ống ly tâm dung dich sucrose 50% và lắc đều.
Bước 4: Tiến hành ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Sau ly tâm, tiến hành thu phần dịch nổi, bao tử nắm nằm trong dịch sucrose. Lọc qua lỗ ray có kích thước 40 pm và rửa dé loại bỏ đường sucrose.
Bước 6: Thu bào tử trên mắc rây. Tiến hành quan sát và đếm mật số cộng đồng bảo tử dưới kính soi nồi.
Quan sát tiêu bản bào tử nam cộng sinh ré. Dùng mũi kim đặt bao tử vào dung dịch PVLG + thuốc thử Melzers dé quan sát tiêu bản, dé yén 5 phut cho bé mat dung dịch khô. Day lame lên mỗi giọt dung dịch nhẹ nhàng. Dùng dau kim ấn trực tiếp lên lame ở mỗi bào tử dé thành bao tử vỡ ra. Các tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi, mô tả hình dạng, kích thước, mau sắc, số lớp của thành bao tử, hình dạng cuống bao tử (nếu có) của bảo tử nắm rễ nội cộng sinh dưới kính hiển vi.
Đánh giá mức độ nhiễm bệnh trên cây trồng Đếm số lượng u sưng trên bộ rễ (u sung/ré).
Mật số tuyến trùng ký sinh di động có trong 50 g đất và kết hợp quan sát đưới kính hién vi và kính hiển vi soi nối.
Cấp độ thương tôn ở rễ dựa theo Shurtleff và Averre (2000) phân thành 5 cấp.
Cấp 0: Không có u sưng trên bộ rễ Cấp 1: Từ 1 — 2 u sưng trên bộ rễ Cấp 2: Từ 3 — 10 u sưng trên bộ rễ Cấp 3: Từ 11 — 30 u sưng trên bộ rễ Cấp 4: Từ 31 — 100 u sưng trên bộ rễ Cấp 5: Trên 100 u sưng trên bộ rễ
Tỉ lệ bệnh được tính dựa theo QCVN 01-172 với công thức:
Tổng số rễ bệnh x 100 Tổng số rễ điều tra Tỉ lệ bệnh (%) =
Tổng số rễ bệnh x 100 Ti lệ bệnh (%) = Tổng số rễ điều tra 2.3. Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý sơ bộ bằng Microsoft Excel 2010 và phân tích phương sai ANOVA) và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3