2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian dự kiến từ tháng 2 năm 2023 đến tháng 8 năm 2023
Địa điểm nghiên cứu: phòng vi sinh (RIBE 208) tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nhà lưới tại Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh và vườn ớt tại xã Nhuận Đức, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu đất và cây trồng được thu thập tại Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh.
Giống ớt hiểm lai F1 SANTA 8.0 của công ty East — West Seed
Chế phẩm sinh học nam nội cộng sinh Mycorrhiza được hỗ trợ bởi dé tai của sở khoa học và công nghệ “Nghiên cứu sản xuất nam nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) nhằm kiểm soát tuyến trùng và một số nam bệnh gay hại trên rau tại khu vực TP. HCM”. Chủ nhiệm dé tài: TS. Trương Phước Thiên Hoàng
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Cân kỹ thuật, máy ly tâm, kính hiển vi quang học, kính hiển vi sôi nổi, nồi hấp tiệt trùng autoclave, tủ cấy, tủ ủ, tủ lạnh, lò vi sóng.
Dụng cụ: Đèn cồn, mũi mác, đĩa petri, chai thuỷ tinh, que cấy, ray lọc 500m và 40um, bình tia, ống ly tâm, dao, các túi zip đựng mẫu, cốc nhựa đựng mẫu, buồng đếm AM, buông đêm hồng cầu, lamelle.
Chuẩn bị giá thé trồng cây, đất trồng cây được trộn với đất tribat. Khay ươm,
chậu nhựa có kích thước miệng chau x đáy chau x cao là 25x20x2lem.
2.2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá khả năng kiểm soát Phytophthora sp. gây bệnh trên cây ớt của chế phẩm sinh học có nam AM trong điều kiện nhà lưới.
Nội dung 2: Đánh giá kha năng kiểm soát nam Phytophthora sp. gây bệnh trên cây ớt của chế phẩm sinh học có nắm AM ở điều kiện ngoài đồng ruộng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Đánh giá khả năng kiểm soát Phytophthora sp. gây bệnh trên cây ớt của chế phẩm sinh học có nam AM trong điều kiện nhà lưới.
2.3.1.1. Kiểm tra nguồn bệnh và chuẩn bị nguồn bệnh
Nguồn bệnh lây nhiễm là Phytophthora sp. đã được lưu trữ và định danh tại
Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
2.3.1.2. Bồ trí nghiệm thức
Chuẩn bị giá thể trồng cây, đất trồng cây được trộn với đất tribat giúp tăng độ tơi xốp và dinh dưỡng cho đất và xơ dừa. Sau khi trộn xong được đem di hấp khử trùng và phơi khô. Sau đó cho vào mỗi chậu khoảng 2 kg đất khô. Tiếp đến tưới nước cho đủ độ âm dé trồng cây.
Bồ tri thí nghiệm được thực hiện theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, don yếu tố có 5 nghiệm thức với ba lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 30 chậu.Được thực hiện trong bảng 2.1. Mật số bao tử nam AM có trong chế phẩm 10° bào tử/ kg chế phẩm, gồm có
2 chi: chi Glomus và chi Acaulospora.
Tổng số cây cho điện tích trong khu thí nghiệm nhà lưới là 150 cây. Thực hiện
tại nhà lưới Viện Nghiên cứu Công Nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm TP.HCM
Bảng 2.1. Bồ tri thí nghiệm trong nhà lưới
Nghiệm thức Thành phần
NTI (BC+) Cây + 10 ml nguồn bệnh NT2 (ĐC-) Cây + không nguồn bệnh
N13 Cây + 2,5g chế phẩm AM/kg giá thé + 10ml nguồn bệnh NI4 Cây + 5,0g chế phẩm AM/kg giá thé+ 10ml nguồn bệnh NT5 Cây + 10g chế phầm AM/kg giá thé + 10 ml nguồn bệnh
Sau khi xử lý đất và trồng cây vào chậu, tiến hành bổ sung chế phẩm sinh học nam AM lần 1, tiến hành chủng bệnh sau 10 ngày bổ sung chế phẩm AM lần 1 với nồng độ 10° bào tử/ml, khoảng 10ml dung dich bào tử/chậu. Tiến hành bé sung chế phẩm sinh học lần 2 sau 15 ngày xử lý lần 1. Cần chăm sóc tưới nước đầy đủ cho cây, đất trong chậu cần phải đủ âm và theo dõi cây.
Thời gian theo dõi các nghiệm thức sau 7, 14, 21 và 28 ngày sau khi xử lý lần 2.
2.3.1.3. Phương pháp theo đối các chỉ tiêu của cây
Các chỉ tiêu theo doi bao gồm:
Số lá (la/cay): đến số lá trên cây, chỉ tính lá đã thấy rõ phiến và cuống lá.
Chiêu cao cây (cm): dùng thước cuộn đo chiêu cao của cây được do bat dau từ
gốc đến hết phần ngọn chồi.
Chiều dài rễ (cm): đo chiều dài rễ được đo từ điểm giai nhau giữa thân với rễ đến đỉnh sinh trưởng của bộ rễ.
Số lượng rễ (rễ): đếm số rễ cấp 1 của cây
Sinh khối rễ: bộ rễ sau khi nhồ lên được rửa sạch, dé ráo sau đó cân trọng lượng rễ tươi.
Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh (%), hiệu lực phòng trừ
Mật số nam AM trong 100g đất (bào tử), tỷ lệ cộng sinh nam AM trong rễ cây
(%).
2.3.1.4. Xác định tỉ lệ rễ cây bệnh và chỉ số bệnh
Khi tiến hành đánh giá tỉ lệ bệnh trên cây ớt do chi Phytopthora, ta dựa vào theo QCVN 01- 172:2014 và thang do phân cấp của rễ bị hại BVTV.
Tổng số rễ bị bệnh
Tỉ lệ rễ bệnh (%) = x 100
Tổng số rễ điều tra
d(axb)
NXT
Chi số bệnh (%) = x 100
Trong đó:
a: SỐ lượng rễ bệnh
b: trị số của mỗi cấp tương ứng
N: trị số bệnh cao nhất trong bảng phân cấp T: tông số rễ điều tra trên 1 cây
Cấp bệnh được đánh giá theo Ahmed và ctv (2020), gồm 5 cấp bệnh:
Cấp 0: không có rễ cây bị thối Cấp 1: 1- 25% rễ bệnh
Cấp 2: 26 — 50% rễ bệnh Cấp 3: 51 — 75% rễ bệnh Cấp 4: 76 — 100% rễ bệnh 2.3.1.5. Lây nhiễm nhân tạo
Nguồn bệnh Phytophthora được định danh và lưu trữ tại phòng thí nghiệm (RIBE208), sau khi nuôi cấy 6 ngày trên môi trường CRA (ca rốt 600 g; CaCO; 15 g;
agar 15 g; nước cất 1000 ml), sau đó xem các đặc điểm hình thái của cành sinh bao tử, các hình dang của sợi nam. Sau đó sử dụng môi trường CR 20% (cà rốt 120 g; CaCO;
3g; nước cat 1000 ml) để nhân sinh khối. Cay từng khoang nắm 4 - 5 mm vào dia petri, thêm 10 - 15 ml môi trườn CR 20% và ủ tối trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tản nắm có đường kính 2 - 2,5 cm. Rửa tan nắm bằng nước cất tiệt trùng 2 - 3 lần, tiếp đến cho vào 10 - 15 ml dung dịch khoáng MSS (Chen và Zentmyes, 1970):
(Ca (NOss -H20 4 g; MgSO4.H20 2,66 g; KNO¿ 0,51 g; nước cất 1000 ml) đã bổ sung
vào 1 ml Chelated (EDTA 0,652 g; FeSO4.7H20 1,245 g; KOH 0,375 g; 50 ml nước
cất). Phơi sang 4 ngày trong tu ủ dé tản nam hình thành bao tử túi. Sau đó quan sát khi bào tử túi chuyên sang bọc chứa các du động bảo tử thì tiến hành kích thích túi bào tử bằng các sốc nhiệt. Tiếp đến thay dung dịch khoáng bang nước cất tiệt trùng, làm lạnh 30 phút ở tủ đông sau đó dé nhiệt độ phòng 30 phút dé bào tử giải phóng du động bao tử. Điều chỉnh nồng độ thử nghiệm là 10° bào tử/ml chậu dé chủng bệnh trên cây ớt.
Chuẩn bị nồng độn dịch bao tử: dịch động bào tử được đếm bằng buồng đếm hồng cầu Thomas. Mật số bào tử được tính theo công thức:
4000xax10?x10"
Công thức tinh mật số bao tử: D = 5 ( bảo tử/ml)
Trong đó:
D: Mật số bào tử (bào tử/ml) a: Số lượng bào tử trong 25 ô lớn b: Số ô nhỏ trong 25 ô lớn.
2.3.1.6. Đánh giá mật số bào tử của bào tử AM trong đất
Bào tử được tách khỏi đất theo kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết hợp với
phương pháp ly tâm trong dung dịch sucrose 50% của Brundrett và ctv (1996).
Bước 1: Loại bỏ các hạt đá to và rác thô trong mẫu đất sau đó cân 50g đất, sau đó cho vào cốc cho 500ml nước cất, khuấy đều trong khoảng 30 phút để hoà tan các hạt đất. Sau đó vớt phần nồi lên trên mặt cốc.
Bước 2: Khuấy đều dung dịch đất rồi để yên khoảng 1 phút cho các thành phần đất to lắng xuống, sau đó lọc dung dịch đất qua rây lọc có kích thước lỗ rây lần lượt là
500 um và 40 um, rửa dưới vòi nước cho đến khi nước đi qua ray không còn màu đục.
Bao tử nắm sẽ được giữ lại trên rây lọc có kích thước lỗ 40tn.
Bước 3: Thu phan đất trên sàng 40 “m cho vào khoảng 1/3 ống falcon thê tích 50 ml, sau đó thêm 2/3 dung dịch sucrose 50% lắc đều.
Bước 4: Tiến hành ly tâm với tóc độ là 2000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Sau ly tâm, tiến hành thu phần dịch nổi, bào tử nam nằm trong dịch sucrose. Lọc qua lỗ ray có kích thước 40 um và rửa lại bang nước loại bỏ hết phần
đường sucrose.
Bước 6: Thu lại bao tử trên ray, sau đó đem quan sát và đếm mật số bao tử dưới kính soi nồi.
2.3.1.7. Định danh bào tử nắm AM dựa vào đặc điểm hình thái
Quan sát tiêu ban bào tử nam nội cộng sinh rễ AM. Bảo tử nắm AM sau khi ly tâm được tiến hành nhuộm qua (thuốc nhuộm PVLG + thuốc thử Melzer) theo tỉ lệ 1:1, lên lame khoảng 5 phút. Quan sát cấu trúc bào tử nắm AM dưới kính hiển vi, dùng đầu kim ấn nhẹ trực tiếp lamelle dé tạo ra vết nứt chữ V, dé dễ dàng quan sát thành bao tử. Các tiêu ban được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X và mô tả kích thước, màu sắc, hình dạng, số lớp của thành bào tử, hình dạng cuống bao tử (nếu có) của bào tử AM dựa vào các mô tả của Brundrett và cộng sự (1996).
2.3.1.8. Phương pháp nhận diện nam AM cộng sinh trong rễ
Sự hiện diện của nắm AM trong rễ có thé được nhận diện bằng cách tiễn hành nhuộm mẫu rễ theo phương pháp của Philips và Haymam (1970). Rễ sau khi thu về được rửa sạch dưới vòi nước dé loại bỏ đất.
Bước 1: Cắt rễ ra thành từng đoạn dai 1cm nếu rễ to phải thái thành lát mỏng cho vào ống fancon 50ml. Sau đó ngâm cho dung dịch KOH (10%) vào ống, đem đun khoảng 25 - 30 phút ở nhiệt độ 80°C đề tây tế bào chat trong rễ.
Bước 2: Rửa sạch mẫu rễ với nước đến khi hết màu nâu rồi tiếp túc ngâm mẫu rễ với HCl (2%) khoảng 15 phút dé trung hòa KOH.
Bước 3: Rửa mẫu ré lại với nước nhiều lần, tiếp tục nhuộm mẫu rễ với Trypan blue (0,05%) khoảng 20 phút ở nhiệt độ 80°C.
Bước 4: Sau đó quan sát 100 đoạn rễ ngẫu nhiên và ghi nhận cấu trúc xâm nhiễm dưới kính hiển vi ở vật kính 40X. Và tiến hành xác định các cấu trúc dạng bụi, túi, sợi nắm dựa theo khoá phân loại của Brundrett (2004).
Đánh giá tỉ lệ nhiễm nắm nội cộng sinh (AM) theo công thức:
Tổng số đoạn rễ hiện diện AM
Tỷ lệ nhiễm nắm cộng sinh (%) = X100
Tông sô rễ quan sat
2.3.1.9. Hiệu lực phòng trừ (%)
* Đối với nam bệnh: Hiệu lực thuốc được tính theo công thức Abbott:
E (%) = (1-Ta/Ca) *100
Trong đó: E: hiệu lực thuốc khảo nghiệm;
Ca: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng tại thời điểm điều tra sau xử lý thuốc.
Ta: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý thuốc tại thời điểm điều tra sau xử lý thuốc.
2.3.2. Đánh giá khả năng kiểm soát nam Phytophthora sp. gây bệnh trên cây ớt của chế phẩm sinh học có AM ở điều kiện ngoài đồng ruộng
Thí nghiệm ngoài đồng ruộng được bồ trí theo kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. Mỗi NT được bố trí 2 líp, mỗi lip 40 cây (80 cây/ NT). Tổng số cây thí nghiệm: 80 cây/NT x 3LLL x 4NT = 960 cây.
Bảng 2.2. Nghiệm thức ngoài đồng ruộng
Nghiệm Sản phẩm thử nghiệm Thời gian và liều lượng xử lý
thức
NII Chế phẩm sinh học AM thị Lan 1:khi mới trồng cây (20g/cây)
trường Lần 2: sau khi trồng 15 ngày (20g/cây)
NT2 Thuốc hoá học thị trường Xử lý sau khi trồng 15 ngày (50g/16L,tudi (EDDY 72WP) theo liều lượng khuyến cáo 200ml/cây)
NT3 Chếphẩm sinh hoc AM thir Lần 1:khi mới trồng cây (20g/cây) nghiệm Lần 2: sau khi trồng 15 ngày (20g/cây)
NI4 Đối chứng
Sản phẩm sinh học thị trường: chế phẩm sinh học MYCORRHIZA - Viện Thổ
Nhưỡng Nông Hoá — Bộ Nông Nghiệp va PINT
Sản phẩm thuốc hoá học thị trường: EDDY 72 WP (hoạt chất: Cuprous oxide 600g/1 + Dimethomorph 120g/1) — Công ty Cô phan Đầu tư Hop Trí
Sản phẩm sinh học thử nghiệm: chế phẩm sinh học RIBE-MYCO Bang 2.3. Sơ đồ bồ trí thí nghiệm đồng ruộng
NT4
LLL3 NT1NT2
NT3 NT2
LLL2 NT4NII
NT3 NT4