DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 7 năm 2023 tại phòng Nghiên cứu và Phát triển Công ty cô phần phân bón Bình Điền đường Nguyễn Văn Tuôi, ấp 4, xã Long Dinh, huyện Cần Đước, tinh Long An.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Phân bón NPK (21 - 18 - 13 + Econanomix), NPK (21 - 18 - 13 + TE), NPK (21
- 18 - 13 + TE + B1), NPK (21 - 18 - 13) do công ty cô phần phân bón Bình Điền cung cấp.
TE ( bao gồm các chelate của Ca, Mg, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo)
Vitamin b]
Econanomix: bao gom cac oxit kim loai cua Si, Mg, Zn, Ca, Cu, Mn, Fe, Bo, Mo hoà tan trong dung dịch được đưa về dang nano với kích thước từ 10 - 100 nm do công ty cổ phan phân bón Bình Điền đang nghiên cứu chuẩn bị cung cấp thị trường.
Hạt dưa leo giống F1-343.
Thuốc nhuộm gram (Crytal violet, safranin).
Môi trường kiểm tra Azosirillum theo TCVN 6166:2002 (Axit malic 5,0 g; KOH
4,0 g; K:HPOx0,5 g; FeSO4.7H20 0,05 g; MnSO4.H20 0,01 g; MgSO4.7H20 0,1 g; NaCl 0,02 g; CaCl: 0,01 g; Na2MoO, 0,002 g; dung dich congo đỏ 1% 2,5 ml; thạch bột 15,0
ứ; nước cất bố sung vừa đủ 1000 ml).
Môi trường PCA ( peptone 5,0 g; cao nam 2,5 g; D-glucose 1 g; thạch bột 15,0 g;
nước cat bô sung vừa đủ 1000 ml).
Giá thé trồng cây bao gồm xơ đừa, đất, hữu cơ đa dung và biochar được trộn với
tỷ lệ (50 : 30 : 15 : 5) cùng với phân vi sinh Azospirillum và Bacillus được hoa tan trong nước và ủ trong vòng 10 ngày.
3.2.2. Dụng cụ thí nghiệm
Ong đong các loại 100, 1000 ml.
Becher các loại 100, 1000 ml.
15
Micropipet các loại: 100 pl, 1 ml.
Thước cây 50 cm.
Thước cuộn 3 m.
Túi trồng cây 20 x 40 em.
Các dụng cụ thí nghiệm khác như: đũa khuấy (đũa thuỷ tinh, đũa sắt), giấy bạc, muỗng khuấy, đĩa petri, v.v.
3.2.3. Thiết bị Kính hiển vi Nồi hấp
Tủ cấy vi sinh Bếp điện
Can điện tử Máy đo độ brix
Máy đếm khuẩn lạc
3.2.4. Phương pháp nghiên cứu
3.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng và năng suất của cây dưa leo
Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bồ trí theo kiêu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10 cây, tổng số cây là 120 cây. Bao gồm 4 công thức NPK :
Công thức 1: NPK 21 - 18 - 13 + Econanomix Công thức 2: NPK 21 - 18 - 13 + TE
Công thức 3: NPK 21 - 18 - 13 + TE+ BI
Công thức 4: NPK 2I - 18 - 13 (đối chứng)
Phân bón nền NPK 21 - 18 -13 được công ty Bình Điền cung cấp và sử dụng theo tiêu chuẩn công ty, vì chủ yếu nhằm nghiên cứu các chất bổ sung phân bón nên công thức phân bón nền không làm ảnh hưởng đến sự khác biệt giữa các công thức.
16
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tại nhà lưới 4:
Khu nhà máy phân bón
Lần
lặp lại CT 1.3 CYr2.3 cr3.3 CT 4.3 3
Lan
Duong | lap lai CT 1.2 CT 2.2 CT3;2 CT 4.2 Al |2
Lan
lap lai CT 1.1 CT 2.1 CT3] CT 4.1 1
Nha xe Cách thực hiện:
Giá thể:
Giá thé trồng cây bao gồm mun xơ dừa được ngâm trong nước vôi trong 7 đến 10 ngày sau đó rửa cho hết nước đục, trộn với đất, biochar và hữu cơ đa dụng được trộn với tỷ lệ (50 : 30 : 15 : 5) cùng với chế phẩm vi sinh do công ty Bình Điền cung cấp được hoa tan trong nước theo tỷ lệ 500 g cho 1 tấn giá thé và phun vào đồng giá thé đảo đều ủ kín trong vòng 10 ngày, sau đó tiến hành cho giá thể vào các túi đựng đường kính 20 x 40 cm mỗi túi 5 kg giá thể.
Chuan bị cây con:
Quá trình chuẩn bị cây con được tiễn hành tuần tự theo các bước sau:
Bước 1: Ngâm hạt giống trong nước âm 35 - 40 °C trong vòng 4 đến 6 giờ.
Bước 2: Vớt hạt được ngâm rửa sạch nhớt và ủ.
17
Bước 3: Sau 1 đến 2 ngày khi hạt nảy mầm tiến hành ươm hạt vào khay xốp có nền giá thé đã chuẩn bị giá thé ươm hạt giống như trên, mỗi lỗ ươm | hạt, tưới âm sau
khi ươm và chăm sóc.
Bước 4: Cây con mọc sau 7 - 10 ngày, chiều cao cây đạt 5 - 7 cm và có từ 2 lá thật, tiến hành trồng cây con vào các túi giá thé đã chuẩn bị.
Quy trình bón phân:
Nông độ phân bón được hoà tan là 1 g/lit. Dung dich phân bón được chứa trong các bồn của hệ thống tưới nhỏ giọt, sau đó được cài đặt thời gian và lượng nước tưới theo chế độ nước và dinh dưỡng của cây, mỗi lần tưới 0,25 | nước số lần tưới và lượng nước tuỳ theo giai đoạn phát triển của cây.
Chế độ nước và dinh dưỡng:
Tiến hành bồ trí các túi giá thé theo sơ đồ bồ trí hình 1.
Chế độ tưới nước và dinh dưỡng cho cây được chia thành 3 giai đoạn như sau:
Giai đoạn 1: Tổng lượng nước 0 - 10 ngày sau trồng là 0,5 lit/ngay.
Giai đoạn 2: 10 ngày tiếp theo đến ra hoa 1 lit/ngay.
Giai đoạn 3: Từ 20 ngày đến khi cuối vụ mùa tông lượng nước 2 lít/ngày.
Chăm sóc và theo dõi:
Tiền hành phun sương nhằm giảm nhiệt độ của nhà màng bằng vào thời tiết nắng nóng từ 3 - 5 phút mỗi ngày 3 - 4 lần.
Sau khi cây dua leo từ 10 đến 14 ngày, cây cao khoảng 20 - 30 cm tiến hành cố định cây dua leo bằng cách quấn ngọn cây dua leo vào dây treo, cùng lúc tiến hành bam ngọn ở vị trí 2 - 4 lá trên cành cấp 1.
Sau khi cây ra hoa tiến hành hỗ trợ thụ phấn thủ công cho cây dưa leo vào các buổi sáng sớm và chiều mát tránh nhiệt độ quá cao.
Theo dõi tình hình phát triển sâu bệnh trên cây dưa leo và có biện pháp phòng ngừa sâu bệnh kip thời khi phát hiện sâu, bệnh hại. Một số địch hại thường gặp trên cây dưa leo như: bọ trĩ, bệnh sương mai, ruồi đục quả, phan trang, bo dưa,...
Thu hoach:
Tiến hành thu hoạch khi quả đã cho lớn, da láng, thu hoạch qua cho đến khi chat lượng quả đã giảm đáng kẻ.
Chỉ tiêu theo dõi:
18
Chiều cao cây dua leo (cm): chiều cao cây dưa leo được lay vào 3 giai đoạn lần lượt sau 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày sau trồng, dùng thước đo từ gốc đến ngọn sinh trưởng và ghi nhận chiều cao của cây.
Ngày ra hoa (ngày): quan sát trong giai đoạn này cây mat bao nhiêu ngày để ra hoa, chỉ tiêu được tính khi trên 50 % số lượng cây trong cùng công thức ra hoa.
Khối lượng trung bình quả (g): Cân tổng khối lượng quả ở từng lần lặp lại sau đó tính khối lượng trung bình theo công thức sau:
m Mb = —
qty
Trong đó: mu là khối lượng trung bình quả trong cùng một lần lặp lai(g) qty là số lượng quả trong một lần lặp lại
m là tổng khối lượng quả trong một lần lặp lai (g)
Chiều dai trung bình quả (cm): do chiều dai từng quả ở mỗi công thức sau đó tính
trung bình theo công thức sau
Lo =—L qty
Trong đó: Lw là chiều dài trung bình qua trong cùng một lần lặp lại (em) qty là số lượng quả
Lla tong chiều dài của các quả trong một lần lặp lai(cm)
Đường kính trung bình quả (cm): dùng thước đo đường kính xác định đường kính
trung bình từng quả trong từng lần lặp lại, được tính theo công thức sau:
dy =——đ
qty
Trong đó: dw là đường kính trung bình quả (cm)
qty là số lượng quả trong một lần lặp lại
dla tong đường kính của quả trong một lần lặp lại (cm)
Năng suất thực thu (kg): dùng cân dé cân tông khối lượng qua của từng lần lặp
lại.
Năng suất lý thuyết (Tắn/ha):là năng suất tính theo lý thuyết dựa trên năng suất
thực thu.
1
điện tích trồng thực tế
Công thức: NSLT= Năng suất thực thu x Trong đó: diện tích trồng thực tế (ha)
19
Năng suất thực thu (tan)
Độ ngọt của quả: dùng máy đo độ brix để đo độ ngọt của quả.
Màu sắc, hình dạng quả, lá,...
3.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến một số vi sinh vật có lợi trong vùng rễ cây dưa leo
Đánh giá ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến vi sinh vật có định đạm:
Lay mau đất: Lay mau đất trước và sau khi thu hoạch dua leo. Mẫu đất nên được lay ở vùng quanh rễ cây từ độ sâu 5 - 10 cm tính từ bề mặt đất.
Pha loãng dat: Cân 10 g đất vào trong bình tam giác chứa 90 ml nước cat vô trùng, lắc đều trộn kỹ. Dé các hạt nặng lắng xuống , thu dung dịch huyền phù. Dùng pipet hút 10 ml dung dịch huyền phù sang ống nghiệm có được dung dịch pha loãng 10°, tiếp tục hút 1 ml dung dịch từ ống nghiệm đầu tiên vào ống nghiệm thứ 2 chứa 9 ml dung dịch nước cat vô trùng trộn đều bằng cách lắc và hút lên hút xuống từ 5 đến 10 lần thu được dung dịch đất với nồng độ pha loãng 107. Lặp lại quá trình này để tiếp tục có các dung dich với nồng độ pha loãng kế tiếp.
Chuẩn bị môi trường theo TCVN 6166:2002 cho vi sinh vật có định đạm bao gồm các thành phần: axit malic 5,0 g; KOH 4,0 g; KzHPO¿ 0,5 g; FeSOu.7H20 0,05 g;
MnSOx.H2O 0,01 g; MgSO4.7H20 0,1 g; NaCl 0,02 g; CaCl2 0,01 g; NaaMoOx 0,002 g;
dung dịch congo đỏ 1% 2,5 ml; thạch bột 15,0 g; nước cất bổ sung vừa đủ 1000 ml.Cho môi trường vào các dụng cụ chứa, hap vô trùng ở 121 °C, áp suất 1 atm trong 30 phút.
Chuẩn bị đĩa cấy: đĩa petri ( đường kính 90 mm) được làm sạch hấp vô trùng ở 121 °C, áp suất 1 atm trong 30 phút, lay ra dé nguội. Môi trường sau khi được hấp khử trùng được lay ra cho giảm nhiệt độ ( khoảng 50 đến 60 °C) tiến hành đỗ đĩa. Lưu ý thé tích khoảng 30 ml, dé nguội đậy nắp. Tất cả các quá trình đồ đĩa và chuẩn bị được thực
hiên trong tủ cây vi sinh vô trùng.
Cay: hút dung 100 ul mẫu từ các ống nghiệm đã pha loãng cho vào đĩa môi trường, sử dụng que cấy trang trãi đều dung dịch trên bề mặt đĩa thạch, đóng nắp, dùng màn bọc thực phẩm bọc mép đĩa và ký hiệu mẫu.
Ủ đĩa đã cấy ở 30 °C trong 72 giờ.
Tiến hành quan sat, đếm khuẩn lac, kết quả được ghi nhận và tính theo công thức
sau:
20
Công thức tinh CFU:
N
NIXVXf1+ nixVxfi
Trong đó: A: số tế bao trong một don vị N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa ni: số lượng đĩa cấy ở nồng độ thứ i V: thể tích mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng ở nồng độ thứ i
Đánh giá ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến Bacillus spp:
Lây mẫu đất: Lây mẫu đất trước và sau khi trồng cây dưa leo. Mẫu đất nên được lay ở vùng quanh rễ cây từ độ sâu 5 - 10 cm tinh từ bề mặt đất.
Pha loãng đất: Pha loãng 10 g mẫu dat trong 90 ml nước vô trùng chứa 0,85 % NaCl. Dé các hạt nặng lắng xuống , thu dung dịch huyền phù. Dùng pipet hút 10 ml dung dịch huyền phù sang ống nghiệm có được dung dich pha loãng 10}, tiếp tục hút 1 ml dung dịch từ ống nghiệm đầu tiên vào ống nghiệm thứ 2 chứa 9 ml dung dịch nước cất vô trùng trộn đều bằng cách lắc và hút lên hút xuống từ 5 đến 10 lần thu được dung dịch đất với nồng độ pha loãng 107. Lặp lại quá trình này để tiếp tục có các dung dịch với nồng độ pha loãng kế tiếp. U mẫu trong bê ủ nhiệt ở nhiệt độ 80 °C trong vòng 10 phút dé hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác do đặt tính của Bacillus chịu nhiệt rat tốt.
Chuẩn bị môi trường PCA nuôi cấy Bacillus spp bao gồm các thành phan: peptone 5,0 g; cao nam 2,5 g; D-glucose 1 g; thạch bột 15,0 g; nước cat bé sung vừa du 1000 ml.
Cho môi trường vào các dung cụ chứa, hap vô trùng ở 121 °C, áp suất latm trong 30
phút.
Chuẩn bi đĩa cay: đĩa petri ( đường kính 90 mm) được làm sạch hap vô trùng ở 121 °C, áp suất 1 atm trong 30 phút, lấy ra dé nguội. Môi trường sau khi được hap khử trùng được lấy ra cho giảm nhiệt độ ( khoảng 50 đến 60 °C) tiến hành đồ đĩa. Lưu ý thể
tích đĩa khoảng 30 ml, dé ngudi day nap. Tất cả các quá trình đô đĩa và chuẩn bị được
thực hiên trong tủ cây vi sinh vô trùng.
21
Cay: hút dung 100 ul mẫu từ các ống nghiệm đã pha loãng cho vào đĩa môi trường, sử dụng que cây trang trãi đều dung dịch trên bề mặt đĩa thạch, đóng nắp, dùng màn bọc thực phẩm bọc mép đĩa và ký hiệu mau.
Ủ đĩa đã cấy ở 30 °C trong 24 giờ.
Tiến hành quan sát, đếm khuân lạc, kết quả được ghi nhận và tính theo công thức
sau:
Công thức tinh CFU:
N
N1IxXVXf1+ nixVxfi
Trong đó: A: số tế bào trong một đơn vi N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa ni: số lượng đĩa cấy ở nồng độ thứ i V: thé tích mẫu (ml) cay vào đĩa fi: độ pha loãng ở nồng độ thứ i
3.2.4.3. Phương pháp nhuộm gram
Cố định mẫu:
Lau sạch lam kính và lamen bằng cồn.
Cho 1 giọt nước lên lam kính.
Dùng que cấy ho đã ho nóng dé nguội chạm vào bề mặt khuẩn lạc
Dùng que cấy trang đều lên bề mặt giọt nước ho trên ngọn lửa đền côn từ 2 - 5 phút cho nước bốc hơi hoàn toàn.
Nhuộm gram:
Cho 1 - 2 giọt dung dich crystal violet lên lam, trang đều, dé khoảng 30 giây đến 1 phút.
Rửa lam kính với nước cho sạch dung dịch màu.
Cho 1 - 2 giọt lugol lên lam dé có định màu, dé trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Rửa nhanh với cồn sau đó rửa lại nước.
Cho 1 - 2 giọt safranin lên lam và trang đều dé trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Rửa lại với nước, dé cho khô nước.
Cho một giọt nước nhỏ lên lam đậy lamen lại và quan sát bằng kính hién vi.
3.3. Xử lý số liệu
22
Số liệu về chiều cao cây, tốc độ sinh trưởng, khối lượng trung bình quả, chiều dài trung bình quả, đường kính trung bình quả, độ brix, năng suất thực thu, năng suất lý thuyết, tổng lượng vi sinh vật cô định dam, tong lượng Bacillus spp được phan tích ANOVA 1 yếu tố bằng phan mềm minitab 16.
Biểu đồ thé hiện chiều cao của cây dua leo ở các công thức qua các giai đoạn sinh trưởng và ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến thời điểm ra hoa của cây dưa leo
được vẽ băng phân mêm Microsoft excel.
23