DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2022 đến tháng 06 năm 2023 tại phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới, số 9/621 xa lộ Hà Nội, Linh Trung, Thủ Đức, Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cá tra giống (trọng lượng khoảng 12 — 20 g) dùng dé thực hiện thí nghiệm cam nhiễm; được mua từ trại cá giống Tân Vạn — Đồng Nai.
Cá tra khỏe và bùn được thu nhận từ ao nuôi trồng thủy sản được thu nhận ở xã Tân Thuận Đông, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp và khu vực Cồn Lát thuộc xã Tân Thiéng, huyện Chợ Lach, tỉnh Bến Tre.
Các chủng vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ cá tra bị bệnh nhận từ Phòng Công nghệ Biến đổi Sinh hoc.
3.2.2. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cu: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy vòng, que cấy trang, bình tam giác, bé nhựa 100 lít, bể nhựa 10 lít và một số dụng cụ thí nghiệm cơ bản khác.
Thiết bị: máy đo pH, máy votex, lò vi sóng, máy lắc Shaker, tủ sây Sanyo, nồi hấp ALP, kính hiển vi Leica DMLS, cân tiểu ly, tủ cấy Telstar, máy ly tâm, hệ thống sục
khí.
3.2.3. Môi trường và hóa chất sử dụng nghiên cứu 3.2.3.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường Nutrient Agar (NA):
Peptone 5g Yeast 3g NaCl lg Agar 18g Nước 1000 mL
16
Môi trường Luria Bertari Broth (LB):
Peptone 10g Yeast 5g NaCl 10g Agar 18g Nước 1000 mL
Nước muối sinh lý 0,9%:
NaCl 9ứ
Nước 1000 mL
Tất cả các môi trường đều được hấp ở 121°C/1atm trong 20 phút.
3.2.3.2. Hóa chất khác
Thuốc thử nhuộm gram: lugol, crytal violet, ethanol 96%, safrarin, dau soi kinh
100X.
3.3. Phuong pháp nghiên cứu
3.3.1. Thu mẫu
Mau cá tra khỏe và mẫu bùn được thu từ ao nuôi trồng thủy sản ở xã Tân Thuận Đông, huyện Cao Lãnh, tinh Đồng Tháp và khu vực Cén Lat thuộc xã Tân Thiéng, huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre.
Mẫu bùn được chứa trong bình thủy tinh vô trùng, mẫu cá được chứa trong các túi PP vô trùng. Mau được trữ trong thùng đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
3.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Đối với mẫu cá: rửa sạch và khử trùng bên ngoài bằng cồn ethanol 70%, tiến hành giải phẫu lấy phần ruột cá, nghiền và pha loãng với nước muối sinh lý đã tiệt trùng ở
các độ pha loãng khác nhau.
Đối với mẫu bùn: cân 10 g mẫu bùn cho vào bình tam giác chứa sẵn 90 ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, lắc trong 30 phút ở tốc độ 150 vòng/phút, để yên 10 phút sau khi lắc, sau đó hút 1 ml va pha loãng đến nồng độ thích hợp.
Dùng pipet vô trùng dé hút 100 ul mẫu đã pha loãng từ các nồng độ pha loãng, bơm vào dia petri có chứa môi trường nuôi cay LB, cấy trải bằng que cấy trải thủy tinh cho dich mẫu đều khắp mặt thạch, sau đó ủ ở 37°C trong 24 — 48 giờ.
Quan sát đặc điểm hình thái: bề mặt, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc, tiến hành chon lọc các khuẩn lạc nghi ngờ sau đó làm thuần trên dia petri chứa môi trường LB.
17
Quá trình làm thuần được tiến hành 2 — 3 lần cho đến khi khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch thuần nhất. Chọn khuẩn lạc don đã được làm thuần cấy truyền vào các ống nghiệm chứa
môi trường thạch nghiêng, bảo quản ở 37°C trong 1 — 2 ngày. Khi các chủng vi sinh vật
đã phát triển kin mặt thạch, bao quan sinh khối giống trong Glycerol 20% ở - 20°C.
3.3.3. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn
Đối với vi khuẩn gây bệnh, tiến hành khảo sát các đặc tính sinh lý và sinh hóa cơ bản nhằm so sánh với các chỉ tiêu của các vi khuẩn gây bệnh nghi ngờ. Sau đó tiễn hành thí nghiệm cảm nhiễm xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra.
Đối với vi khuẩn có lợi, sau khi tiến hành ức chế dé chon lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, quá trình khảo sát các đặc tinh sinh lý sinh hóa sẽ được thực hiện sau nhằm tiết kiệm thời gian cũng như hóa chất khi thực hiện thí
nghiệm.
3.3.3.1. Phương pháp nhuộm gram
Nguyên tắc: vi khuẩn gram (+) có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, có khả năng giữ phức hợp tim tinh thé iod (crystal violet). Vi khuẩn gram (-) có thành tế bào peptidoglycan mỏng hơn và thường có thêm lớp mang lipopolysaccharid bên ngoài, không giữ được màu tím khi rửa qua cồn, nên chỉ màu đỏ tia của thuốc nhuộm kiềm (safarin).
Chọn khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành làm tiêu ban cần nhuộm: nhỏ 1 giot nước cất lên tiêu bản, lay một it sinh khối, hòa tan với nước và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng thuốc nhuộm tỉnh thê tim (crystal violet) nhuộm mẫu trong 1 phút, sau đó rửa nước 5 giây va dé khô tự nhiên. Thêm dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa bằng nước trong 5 giây và tiếp tục rửa qua cồn 96% trong 10 giây. Rửa lại nước 5 giây và dé khô tự nhiên. Nhuộm tiếp với safarin trong 1 phút. Sau đó rửa nước 5 giây, dé khô và tiến hành quan sát trên kính hiển vi.
3.3.3.2. Thử nghiệm khả năng di động
Nguyên tắc: kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn trên thạch ban lỏng (0,3 - 0,6% agar). Vi sinh vật di động sé làm môi trường đục, phát triển là lan ra khỏi vết cay.
Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy và không lan ra khỏi vết cấy.
Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường thạch bán lỏng (môi trường LB với 0,5%
agar), sau đó hấp khử trùng ở 121°C. Dùng que cấy có đầu nhọn, lấy sinh khối vi khuẩn
18
và đâm sâu vào môi trường thạch. Đặt ống nghiệm thăng đứng, ủ ở nhiệt độ phòng và
quan sát sau 1 - 3 ngày.
3.3.3.3. Thử nghiệm kha năng sử dung citrate
Nguyên tắc: thạch citrate được sử dụng dé kiêm tra khả năng sử dung citrate là nguồn năng lượng của vi khuân. Môi trường có chứa citrate là nguồn carbon duy nhất, muối ammonium là nguồn ni tơ chính. Nếu có vi khuẩn phát triển chứng tỏ có sử dụng citrate. Khi vi khuân chuyền hóa citrate, muối anmonium sẽ bị giáng hóa thành amoniac làm kiềm hóa môi trường. Chất chỉ thị xanh bromthymol trong môi trường sẽ chuyền từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biên khi pH trong môi trường trên 7,6.
Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường citrate, hấp khử trùng ở 121°C và tiến hành nghiêng ống nghiệm khi vừa hấp xong. Dùng que cay vòng, lay sinh khối vi khuẩn và ria một đường thang lên mặt thạch. Đặt ống nghiệm thang đứng, ủ ở nhiệt độ phòng
và quan sát sau - 7 ngày.
3.3.3.4. Thứ nghiệm trên môi trường thạch TSI
Mục đích: xác định kha năng lên men carbonhydrat, sinh hơi và sinh HaS của vi
khuẩn.
Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường TSI, hấp khử trùng ở 121°C và tiến hành nghiêng ống nghiệm khi vừa hấp xong. Dùng que cấy có đầu nhọn, đâm sâu vào phần thạch cách đáy ông 3 — 5 mm, kéo que cấy lên ria hết phần thạc nghiêng. Đặt ống nghiệm thang đứng, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát trong | - 7 ngày.
3.3.3.5. Thử nghiệm sinh Oxidase
Nguyên tắc: ở một số vi khuẩn, tế bào có enzym cytochrome oxidase. Khi có mặt oxy, enzyme này có khả năng oxy hóa thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine là chất nhận điện tử trong chuỗi hô hấp tế bào tạo thành indo phenol - một phức hợp có màu
tím đậm.
Tiến hành chọn một khuẩn lạc đơn phết lên giấy lọc, sau đó nhỏ hóa chất oxidase lên khuẩn lạc và quan sát hiện tượng, khuẩn lạc sinh oxidase sẽ bắt màu tím.
3.3.3.6. Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc: vi khuẩn sinh enzyme catalase đề thủy phân H2O> thành HzO và O2 tạo ra bọt khí. Xét nghiệm này được dùng để phân tích đặc điểm ban đầu của hầu hết
các vi khuân.
19
Ong nghiệm sau khi thử nghiệm khả năng di động của vi khuẩn sẽ có sinh khối mọc trên bề mặt thạch. Tiến hành nhỏ vài giọt H2O2 vào và quan sát. Nếu xuất hiện bọt khí thì vi khuẩn có sinh enzyme catalase và ngược lai.
3.3.4. Phương pháp gây cảm nhiễm xác định vi khuẩn gây bệnh
Cá thí nghiệm: cá tra giống thí nghiệm có trọng lượng khoảng 15 — 20 g/con, không có biểu hiện bệnh hay nhiễm nắm. Cá mua về được nuôi thuần dưỡng 1 tuần trong bể nhựa (đã được tiệt trùng bằng chlorine); sục khí va cho ăn hàng ngày theo nhu cầu.
Vi khuẩn gây cảm nhiễm: 3 chủng vi khuan được phân lập va chọn lọc từ cá tra bị nhiễm bệnh xuất huyết sau khi khảo sát các đặc tính sinh hóa. Tiến hành hoạt hóa và
tăng sinh trên môi trường NA trong 48 giờ.
Bồ trí thí nghiệm cảm nhiễm:
Thí nghiệm cảm nhiễm được bố trí với 4 nghiệm thức (NT): NT1, NT2 và NT3 là 3 chủng vi khuẩn đã được phân lập trên cá tra nhiễm bệnh với mật độ vi khuẩn cảm nhiễm là 108 CFU/ml và 1 NT đối chứng là cá tra khỏe không gây cảm nhiễm. Các NTI, NT2, NT3 được ngâm trong dich vi khuẩn trong 3 giờ, có sục khí; NT đối chứng (ĐC) được ngâm trong nước muối sinh lý. Sau khi ngâm cảm nhiễm, cá được thả ra các bể chứa nước bình thường. Mỗi NT được lặp lại 3 lần với mật độ 10 con ca/bé.
Sau khi cảm nhiễm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày. Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt và chết được thu đề giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh xuất huyết và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tang dé xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa. Sau đó, chọn 1 chủng vi khuẩn gây nhiễm bệnh cao nhất đề tiến hành đối kháng với các chủng vi khuẩn có lợi được phân lập từ bùn và cá
tra khỏe.
3.3.5. Khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn có lợi đối với vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra
3.3.5.1. Phương pháp vạch thắng vuông góc
Mục đích: nhằm xác định tính ức chế vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn có lợi, từ đó tiến hành so sánh, chọn lọc chủng vi khuân có khả năng ức chế mạnh nhất ở bước tiếp
theo.
Cách tiến hành: theo Sertac và cộng sự (2014)
Tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh đã được chọn lọc dọc theo một đường thang trén đĩa thạch, ủ ở 37°C trong 24 giờ, tiếp tục cay vi khuẩn có lợi theo các vạch ngang vuông
20
góc với vạch vi khuẩn gây bệnh (không chạm nhau), ủ ở 37°C trong 24 giờ. Kha năng ức chế được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuan theo đơn vị mm.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau thử nghiệm đối kháng sơ bộ. chọn lọc các chủng vi khuẩn có tính ức chế vi khuẩn gây bệnh mạnh nhất dé cay truyền những lần tiếp theo.
3.3.5.2. Phương pháp khuếch tán giếng thạch
Mục đích: nhằm so sánh, chọn lọc ít nhất 2 chủng vi sinh vật có lợi có khả nang ức chế cao nhất với vi khuân gây bệnh xuất huyết trên cá tra.
Cách tiến hành:
Trên môi trường NA, cấy trang 100 wl dich vi khuẩn gây bệnh và dịch vi sinh vật có lợi lên đĩa thạch ở các nồng độ pha loãng khác nhau, đếm mật độ khuẩn lạc nhằm kiểm tra và lựa chọn độ pha loãng phù hợp. Sau khi lựa chọn được độ pha loãng phù hợp, tiến hành khảo sát khả năng ức chế bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Dịch vi khuẩn gây bệnh được tiến hành hoạt hóa trong môi trường NA và ủ ở nhiệt
độ 37°C trong 48 giờ. Cac chủng vi sinh vật có lợi được hoạt hóa trong môi trường LB
và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ. Sau đó dịch huyền phù của vi khuẩn gây bệnh được điều chỉnh sao cho mật độ vi khuẩn bằng với mật độ của các chủng vi sinh vật có lợi dé tiến hành thử kha năng đối kháng với mật độ tương ứng. Tiến hành bơm 100 pl huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa thạch chứa môi trường NA, cấy trải bằng que cay trang. Sau đó, khoang giếng thạch có kích thước 7 mm trên đĩa thạch, bơm 50 ul dịch vi sinh vật có lợi tương ứng với các nồng độ khảo sát lên bền mặt thạch đã được cấy trải vi khuân gây bệnh, tiếp tục bơm 50 ul nước cất vô trùng dé làm đối chứng âm, đem ủ ở 37°C trong 24 giờ. Khả năng ức chế được đo bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm. Đánh giá khả năng ức chế theo Samthi và Reetha (2012). Mỗi thử nghiệm được lặp lại 3 lần dé đảm bảo độ chính xác. Xác định tính ức chế của chủng vi sinh vật có lợi bang cách đo kích thước vòng kháng khuẩn.
Đánh giá VKK được chia làm 4 mức độ:
Không kháng: kích thước vòng kháng khuẩn = 0 Kháng yếu: kích thước vòng kháng khuẩn < 5 mm
Kháng trung bình: 5 < kích thước vòng kháng khuẩn < 10 mm Kháng mạnh: kích thước vòng kháng khuân > 10 mm
Kích thước vòng khang = D - d
21
Trong đó: d là đường kính lỗ thạch
D là đường kinh vòng kháng khuẩn
Tuyển chọn ít nhất 2 chủng khuẩn có lợi có kích thước VKK lớn nhất, tiến hành kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa và định danh 2 chủng vi sinh vật có lợi đó.
3.3.6. Phương pháp định danh vi khuẩn
Chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết và 2 chủng vi khuẩn có lợi được tuyển chọn khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, tiễn hành định danh vi sinh vật bằng công nghệ khối phổ protein MALDI-TOF (Matrix - Assisted Laser Descraction / Ionization - Time
of Flight) tại Viện Sinh Hoc Nhiệt Đới.
Công nghệ phân tích khối phổ MALDI-TOF dựa trên kỹ thuật ion hóa bằng cách giải hấp hợp chất ra khỏi chất mang bằng tia laser (theo Piseth Seng và cộng sự, 2010).
Các ion khác nhau sẽ được phân tách nhờ sự khác nhau về thời gian bay (TOF - time of flight). Cụ thể, các ion đơn điện tích được tạo ra bằng kỹ thuật MALDI sẽ có sự khác biệt về khối lượng. Vì vậy, những ion có khối lượng lớn hơn sẽ có tốc lực nhỏ hơn, nên mat nhiều thời gian hơn dé bay qua cùng một khoảng đường dai trong một ống không có từ trường. Các ion sau khi được tăng tốc, bay ngang qua một vùng trường tĩnh điện,
nơi đây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị m/z của chúng, và được tập
trung tại bộ phận thu nhận tín hiệu. Do thời gian đến đầu dò của các ion chỉ cách nhau một khoảng thời gian rất ngắn, nên máy cần có hệ thống phát hiện cực nhạy đề có thể
phân biệt được các ion.
MALDI TOF MS sử dụng công nghệ khối phổ protein định danh vi sinh vật, so sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dit liệu của
hơn 8000 chung vi sinh vật khác nhau. Phân tích MALDI TOF MS cho phép định danh
chính xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn ky khí, vi khuẩn hiếu khí, nam mốc... cho phép định danh vi sinh vật trực tiếp từ môi trường thạch hoặc mẫu bệnh phẩm trong thời gian 30 phút với 96 mẫu vi sinh vật.
Ưu điểm là cho kết quả chan đoán nhanh vi sinh vật với độ chính xác cao; dữ liệu được quản lý, cập nhật thường xuyên từ ngân hàng vi sinh vật thế giới, kết quả có giá trị khoa học cao và thường được sử dung cho các mẫu protein đơn giản, và khá tinh sạch. Nhược điểm là không thích hợp cho việc phân tích hỗn hợp protein phức tạp.
Theo Tạ Thị Yến và cộng sự (2021) trong nghiên cứu “Xác định vi khuẩn
Acinetobacter calcoaceticus — Acinetobacter baumannii complex kháng khang sinh 22,
carbapenem phân lập trong rau ăn sống và thịt chế biến sẵn trên địa bàn thành phố Hà Nội” đã xác định được 288 chung vi khuẩn Acinetobacter spp. thu thập được từ các mẫu nghiên cứu và tiễn hành định danh xác định nhóm vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex bang ky thuat MALDI-TOF trén thiét bi VITEK MS.
Kết qua cho thấy 208/288 (72%) chủng Acinetobacter spp. là Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex được xác định với độ tương đồng 99,9%, Trong đó 156/178 chủng phân lập từ mẫu rau và 52/110 chủng phân lập từ mẫu thịt là Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, lần lượt là 88%
và 47% trong nhóm Acinetobacter spp. đã được phan lập.
MALDI TOF không chỉ định danh được vi khuẩn, phương pháp này còn có thé định danh được các loài nam. Cu thé, trong nghiên cứu của Lê Hùng Anh và cộng sự (2022), trong 11 chủng vi khuẩn và 3 chủng nắm mốc được phân lập và làm thuần vi sinh từ mẫu phân voi tươi được kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose và định danh theo phương pháp MALDI TOF và theo khóa phân loại của Bergey. Kết quả định danh cho thấy có 2 chủng là Staphyloccoccus aureus, 5 chủng là Bacillus subtilis và 2 chủng nam mốc lần lượt là Aspergillus fumigatus va Aspergillus niger.
Cach tién hanh:
Các chủng vi khuan được tuyén chọn va vi khuẩn gây bệnh sau khi được nuôi cấy trong 24 giờ, tách lây khuẩn lạc don và phét đều lên đĩa. Sau đó, thêm 1 yl acid formic nhằm phá vỡ thành thé bào của các vi khuẩn, dé khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau khi acid formic khô, tiến hành bơm 1 pl HCCA Matrix nhằm bảo vệ protein của vi khuẩn khi laser bắn vào và đề khô tự nhiên.
Đĩa được phết khuẩn lạc sau đó được đưa vào hệ thống và tạo phổ, so sánh phô với dữ liệu và xem kết quả định danh qua thư viện MBT database version MSP 5627 thuộc hệ thống định danh Maldibioptyper System. Phần mềm định danh: MBT RTC 3.1. Thiết bị Model: Microflex LT/SH; Hãng sản xuất: Bruker/Đức. Kết quả được đánh giá phân tích dựa trên mức tương đồng với database thông qua điểm tương đồng (score values).
3.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Tính toán dựa trên phần mềm Microsoft Office Excel 365 và phần mềm thống kê
Minitab 16.
Xử lí số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Số liệu được xử li được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R > 0.95.
23