DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 4. KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra từ các chủng vi khuẩn gây bệnh cá được nhận từ Phòng Biến đối Sinh học
4.1.1. Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn gây bệnh
Sau khi nhận 3 chủng vi khuẩn T1, T2 và T3 từ Phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, các chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa, nuôi cay trên môi trường NA dé quan sát hình thái và khảo sát các đặc điểm sinh hóa. Các khuẩn lạc của 3 chủng vi khuẩn khác nhau, trong đó chủng vi khuẩn T1 có màu vàng, có roi/ré mọc dài xung quanh. Khuẩn lạc của các chủng T2 và T3 có màu trắng, tròn, trơn, lồi, tuy nhiên chủng T2 có kích thước lớn hơn, khoảng 2 — 3 mm, chủng T3 có kích thước khoảng 0,5 — 1,5 mm. Kết quả ghi nhận về đặc điểm của 3 dòng vi khuan gây bệnh được trình bay ở Hình 4.1.
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các vi khuẩn gây bệnh
. x : Kích thước
STT Ki hiéu mau Mau sac Hinh dang
(mm) 1 T1 Vàng Hỡnh thoi, cú rộ/roi =ủ 2 T2 Trang duc Hình tròn, trơn, lồi, bóng 73 3 T3 Trang duc Hình tròn, trơn, lồi, bong 8ã=15
24
4.1.2. Đặc điểm tế bào của các chúng vi khuẩn gây bệnh
Sau khi nhuộm gram và tiễn hành quan sát đưới kính hiển vi quang học, nhận thay 3 dòng vi khuân có đặc điểm như sau: chủng T1 bắt màu tím của thuốc nhuộm crystal violet, chứng tỏ chủng T1 thuộc nhóm vi khuan gram dương, chủng vi khuẩn T2 và T3 bắt màu hồng của thuốc nhuộm safarin, chứng tỏ chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram âm.
Trong đó có chủng T1 và T2 có dạng hình que ngắn, và chủng T3 có dang hình cầu. Kết quả ghi nhận về đặc điểm của 3 dong vi khuẩn gây bệnh được trình bay ở Hình 4.2 va
Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Hình dạng và kích thước tế bào của 3 chủng vi khuân gây bệnh
; - Kích thước STT Kí hiệu mâu Gram Hình dạng
(um) 1 71 + Que ngan 0,8 — 1,2 2 T2 - Que ngan 0,5 — 1,5 3 T3 “ Cầu chùm 63-1
Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram của 3 chủng vi khuẩn gây bệnh ở độ phóng đại 100X 4.1.2. Kết quá thử nghiệm phản ứng sinh hóa của các chúng vi khuẩn gây bệnh
Sau khi khảo sát các phản ứng sinh hóa, kết qua cho thay cả 3 chủng vi khuẩn đều âm tính với H2S và oxydase. Trong đó chủng T3 âm tính với tất cả các chỉ tiêu được
khảo sát, trong khi chủng T2 chi âm tính với H2S và oxydase, di động mạnh, sinh hoi, dương tính với catalase, citrate, glucose va lactose. Chung TI di động mạnh và sinh
catalase, âm tính với citrate, glucose, lactose, H›S, oxydase và không sinh hơi. Kết quả các phản ứng sinh hóa được thé hiện ở Bảng 4.3.
35
Bang 4.3. Kết quả thử nghiệm một số phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn bệnh
Chỉ tiêu Tl T2 T3 Di động bã
Citrate -
Glucose -Lactose - + + + +
HaS - - - Sinh hoi -
Catalase + + =
+ 1
Oxydase - - - (+): dương tinh, (-): âm tính
4.2. Kết quả cảm nhiễm xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra
Các NTI, NT2 và NT3 sau khi được ngâm trong dich vi khuẩn với mật độ 108 CFU/ml trong 3 tiếng, có sục khí được thả ra ngoài môi trường bình thường với mỗi NT được lặp lại 3 lần (mỗi NT 3 bể) với mật độ 10 ca/bé. Cá ở những NT này được theo dõi trong 14 ngày, và kết qua theo dõi cho thấy NT gây cảm nhiễm với chủng T1 tỷ lệ cá chết là 96,7%, T2 là 100%, T3 là 83,3%. ĐC âm chỉ có 2 cá chết với 6,7%, do cá bị sốc bởi các tác nhân bên ngoài, khi chuyên sang các bể nhỏ hoặc do đào thải tự nhiên. Do đó, quá trình gây cảm nhiễm và chuyền cá sang các bé nhỏ ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm. Cá chết ở các lô gây nhiễm xuất hiện chủ yếu từ ngày đầu tiên và kéo dài đến ngày thứ 11, sau ngày 11 không còn xuất hiện cá chết nữa. Số lượng cá chết tập trung chủ yếu vào ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 của thí nghiệm. Kết quả tỷ lệ cá chết sau 11 ngày quan sát được thé hiện trong biểu đồ Hình 4.3.
26
Tỷ lệ cá chết sau 11 ngày quan sát (%)
120
100
b5= 80
©
+
Đ 60
OO oO
a
>
- 40
20
6 —
‘Tt T2 T3 DC
Nghiệm thức
Hình 4.3. Tỷ lệ cá chết sau 11 ngày quan sát của 3 NT cảm nhiễm 3 chủng
vi khuân gây bệnh
Sau 24 giờ cá được gây cảm nhiễm, kết qua cho thấy cá ở NT1 cảm nhiễm chủng T1 có biểu hiện đặc trưng của bệnh xuất huyết. Đầu tiên là cá kém ăn hoặc bỏ ăn, nổi lờ đờ trên tầng mặt. Da cá đổi màu tối không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp. Cá bệnh xuất hiện các đốm xuất huyết màu đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, râu xuất huyết hoặc bạc trang, mắt lồi, bụng chướng to, các vây xơ rách, tia vây cụt dần. Những cá chết ngày đầu có biéu hiện xuất huyết ở vây cá, cá chết ở ngày thứ 2 xuất huyết nặng hơn, xuất huyết ở vây, minh, hậu môn và đuôi cá. Các NT của vi khuẩn T2 và T3 tuy ti lệ cá chết tích lũy cao nhưng không có biểu hiện xuất huyết. Kết quả được thể hiện qua
T2
27
Sau khi xác định được biểu hiện bệnh xuất huyết ở NT1 cảm nhiễm chủng vi khuẩn T1, cá đã được tiến hành giải phẫu dé kiểm tra nội các tỳ tạng va tai phân lập nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Kết quả sau khi giải phẫu cho thấy gan và thận cá xuất huyết nặng, có chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối, ruột viêm và chứa đầy hơi.
Phân lập mau cá tra có biểu hiện bệnh xuất huyết, mat lồi, xuất huyết nặng ở vay, mình, đuôi và hậu môn từ thực nghiệm. Kết qua tái phân lập cho thấy vi khuẩn tái phân lập có hình thoi, màu vàng, có ré/roi mọc xung quanh, gram dương, hình que ngắn, phản
ứng dương tính với catalase, âm tính với oxydase, di động, không lên men đường
glucose và lactose, không sinh hoi, âm tính với citrate. So sánh với chủng vi khuan T1 đã được khảo sát đặc tính sinh hóa cho kết quả giống nhau. Điều này kết luận chủng vi khuẩn T1 là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá tra.
Bảng 4.4. Bảng khảo sát sinh hóa so sánh giữa chủng vi khuẩn T1 va chủng vi khuẩn
tái phân lập
Chủng vi khuẩn tái
Chỉ tiêu Tl
phan lap Di động + +t
Citrate - - Glucose - - Lactose - - HS - - Sinh hoi - - Catalase + + Oxydase - - (+): dương tinh, (-): âm tinh
28
4.3. Kết quả phân lập vi khuẩn có lợi
Sau khi tiến hành phân lập trên môi trường LB từ 5 mẫu bùn và 5 mẫu cá thu ở 2 ao khác nhau thuộc: Tân Thuận Đông, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp và khu vực Cén Lat, xã Tân Thiéng, huyén Cho Lach, tinh Bén Tre. Két quả thu nhận được 14 chủng vi khuân. Trong đó mẫu bùn ở Cồn Lát phân lập được 3 chủng, kí hiệu lần lượt là CL2.1, CL2.2 và CL2.3, mẫu ruột cá ở Cồn Lát phân lập được 4 chủng, kí hiệu lần lượt là A2A đến A2D. Mẫu bùn ở Tân Thuận Đông phân lập được 4 chủng, kí hiệu lần lượt là TTD2.1 đến TTD2.4 và mẫu ruột cá ở Tân Thuận Đông phân lập được 4 chủng, kí hiệu lần lượt là B2A đến B2D.
Kết quả phân lập cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn có kích thước từ 0,5 — 3 mm, 11 chủng có mau trắng đục, hình tròn hoặc hình hoa, nhám và nhăn, 5 trong11 chủng nhăn có tạo tâm ở giữa khuẩn lạc. Có 2 chủng màu trắng đục, hình tròn, nhám và không nhăn, 1 chủng có mau trang sữa, hình tròn, trơn, lồi và bóng. Kết quả ghi nhận về ký hiệu và đặc điểm của 14 dòng vi khuẩn có lợi được trình bày ở Bảng 4.5.
29
Bang 4.5. Đặc điểm khuan lạc của 14 chủng vi khuẩn có lợi phân lập được
STT Kihiéu Màu sắc Hình đạng Kích thước mẫu (mm) 1 A2A Trang duc Tron, nham, nhan 6 tam 1-3 2 A2B Trang duc Tròn, nhám, nhăn ở tam 8.3 3 A2C Trang duc Tròn, nhắm, nhăn ở tam 2-3 4 A2D Trắng đục Tròn, nhám, ít nhăn 1,5-3 5 CE2.1 Trang duc Tron, nhám, nhăn ở tam 1,5 -—3 6 CL2.2 Trang duc Tron hoặc hình hoa, nhám, nhăn 2-3 7 CL23 Trang đục — Tròn hoặc hình hoa, nhám, nhăn 13-3 8 B2A Trang duc Tron hoặc hình hoa, nhám 2-3 9 B2B Trắng đục Tròn, nhám, nhăn ở tâm 1~8 10 B2C Trắng đục Tròn hoặc hình hoa, nhám, nhăn 2-3 II TTD21 Trắng sữa Tròn, trơn, lồi, bóng 5-15 12 TID22 Trắng đục Tròn, trơn, lồi, nhay 2-4 13 TTD2.3 Trang duc Tron, nhám, nhăn 1-5 14 TTD24 Trắng đục — Tròn hoặc hình hoa, nhám, nhăn LG.
30
4.4. Kết quả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 4.4.1. Phương pháp vạch thẳng vuông góc
Tiền hành thí nghiệm khảo sát khả ức chế vi khuẩn T1 gây bệnh xuất huyết trên cá tra của 14 chủng vi khuẩn phân lập được ở thí nghiệm trước. Khảo sát khả ức chế bằng phương pháp vạch thăng vuông góc nhằm chọn lọc, định tính khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh T1. Kết quả khảo sát trong 14 chủng cho thấy có 8 chủng có ức chế với vi khuẩn gây bệnh T1 gồm CL2.1, A2A, A2B, A2D, TTD2.1, B2A, B2B và B2C. Kết quả xác định định tính khả năng ức chế được thể hiện qua Hình 4.8.
Hình 4.8. Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của các chủng
vi khuẩn phân lập được trên môi trường NA; a) Vi khuẩn ức chế vi khuẩn gây bệnh; b) Vi khuẩn không ức chế vi khuẩn gây bệnh
4.4.2. Phương pháp khuếch tán giếng thạch
Sau khi tiến hành khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh T1 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, kết quả cho thay DKVKK của các chủng thử nghiệm có giá trị từ 1,75 — 10,88 mm. Trong đó, có 2 chủng có đường kính lớn nhất có và có ý nghĩa thống kê so với các chủng còn lại lần lượt là chủng CL2.1 và A2A có ĐKVKK
10,8 mm và 10,5 mm. Kết quả được trình bay cụ thé ở Bảng 4.6. và Hình 4.9.
31
Bang 4.6. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng vi khuẩn bệnh của các chủng vi khuẩn
phân lập được
STT Kí hiệu mẫu Đường kính VKK (mm)
1 CL2.1 10.883 + 0.85 2 A2A 10.50 + 1.00
3 B2A 5.13° + 0.75 4 B2B 5.1354 1.11 5 A2B 4.88° + 0.75 6 A2D 3.75 + 0.87 7 TTD2.1 3.33 + 0.40
8 B2C 1.75° + 1.50
Số liệu đường kính vòng vô khuẩn là giá trị trung bình của ba lan lặp lại. Trong cùng một cột, các giá trị có ký tự theo sau (chữ cái in thường) các chữ cdi khác nhau thể hiện sự sai khác biệt về ý nghĩa thong kê ở độ tin cậy 95% theo kiểm định Turkey (P < 0,05).
4.4. Kết quả định danh vi khuẩn
Ching T1, CL2.1 và A2A được định danh bằng phương pháp MALDI-TOF. Kết quả được tra cứu trên ngân hàng phổ thông qua phần mềm Bruker, dựa vào sự tương đồng của khối phố dé định danh đến cấp độ loài và so sánh kết quả trên ngân hang gen NCBI được thé hiện ở Bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả định danh bằng MALDI TOF và so sánh trên ngân hàng NCBI Dòng tuyển ; : à .
" Loai tuong dong Mức độ tương đông Định danh NCBI
chọn
Tl Kurthia gibsonii 56% 33964 A2A Bacillus velezensis 56% 297145 CL2.1 Bacillus subtilis 59% 1423
Kết qua phân tích khối phô cho thay chủng vi khuân T1 sau khi định danh bang MALDI-TOF có các đỉnh trong khối phố tương đồng với khối phổ của chủng Kurthia gibsonii với độ tương đồng đạt 56%. Chung vi khuẩn có lợi CL2.1 được định danh cho kết quả tương đồng với chủng Bacillus subtilis đạt 56% va chủng A2A có độ tương đồng với chủng Bacillus velezensis đạt 59%. Kết quả cho thấy độ tương đồng không lớn, chưa
đáng tin cậy.
32
Khi định danh bằng MALDI TOF, kết quả phụ thuộc lớn vào hóa chất, độ thuần của mẫu và kĩ thuật khi làm. Đối với kĩ thuật khi làm, trong quá trình định danh, khi phết khuẩn lạc vào đĩa có thể vô tình chạm vào thạch môi trường, thạch môi trường cũng chứa một lượng protein nên ảnh hưởng lớn đến kết quả định danh. Đối với hóa chất, Matrix là chất bảo vệ protein khi laser ban tach protein ra thành các khối phổ, tuy nhiên hạn sử dụng của Matrix chỉ có 7 ngày, nếu matrix quá hạn, không bảo vệ được protein của khuẩn lac thì dẫn đến protein bị phá hủy khi laser tiếp xúc với khuan lạc, điều này cũng ảnh hưởng lớn đến kết quả khi định danh.
Năm 2019, Prasannan Geetha Preena va cộng sự với nghiên cứu “Antibiotic susceptibility pattern of bacteria isolated from freshwater ornamental fish, guppy
showing bacterial disease” tạm dich “ Kha năng nhạy cảm đối với khang sinh của một số vi khuẩn được phân lập từ cá cảnh nước ngọt, cá bảy màu có biểu hiện bệnh” cho thấy rằng Kurthia gibsonii cũng có khả năng kháng thuốc kháng sinh với 5 lớp kháng sinh: Tetracycline (Oxytetracycline), Cephalosoporin thế hệ 3 (Cefixime),
Sulphonamides (Trimethoprim va Azithromycin), Macrolides (Erythromycin) và
Bacitracin với chi số MAR là 0,352. Điều này cho thấy liều lượng kháng sinh ở các trại cá khá cao, dẫn đến việc xuất hiện các gen kháng thuốc kháng sinh ở các loài cá cảnh.
Sự xuất hiện của các loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc kháng sinh nhắc nhở việc giám sát và quản lý chặt chẽ các trại nuôi trong việc phòng chống bệnh và sử dụng các giải pháp thay thế hiệu quả khác.
Từ kết quả nghiên cứu của Preena và cộng sự (2019) cũng cho thấy, khi sử dụng kĩ thuật định danh phân tử bằng khuếch đại và giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy các tác nhân gây bệnh phân lập từ cá vàng (Carassius auratus) bao gồm Klebsiella
aerogenes, Citrobacter freundii, Edwardsiella tarda, Enterobacter cancerogenus, Comamonas testosteroni, Acinetobacter nosocomialis va Kurthia gibsonii khi so sanh với cơ sở đữ liệu GenBank. Trong khi Edward siella tarda, Aeromonas hydrophila, A.
Aquas, A. caviae, Bacillus drentensis, Comamonas Aqua, Comamonas testosteroni, Lactococcis lactis, Acinetobacter junii, Enter obacter cloacae va Kurthia gibsonii da
được quan sát thay trong số các mầm bệnh từ cá Koi. Điều này chứng tỏ Kurthia gibsonii có khả năng gây bệnh trên cá cảnh. Vì vậy, khả năng gây bệnh xuất huyết trên cá tra
hoàn toàn có thê.
Bệnh xuất huyết trên cá tra hiện nay đang được điều trị và phòng bệnh nhờ kháng sinh, vì vậy một số vi khuẩn phố biến gây bệnh phô biến như Aeromonas hydrophila, Edward ictaluri được kháng tối đa và tần suất xuất hiện ít hơn, một số vi khuẩn không phô biến lại có cơ hội dé phát triển, kháng kháng sinh và gây bệnh với tần suất cao hơn và phô biến hơn. Do vậy, Kurthia gibsonii hoàn toàn có thé gây nên bệnh xuất huyết
trên cá tra.
Năm 2007, Brunt và cộng sự đã chứng tỏ chủng Bacillus sp. JB — 1 có phé kháng khuẩn rộng đối với vi khuan gây bệnh trên động vật thủy sản như Streptococcus iniae,
Lactococcus garvieae, Aeromonas salmonicida, Yersinia ruckeri, V. ordalii, V.
anguillarum. Aly và cộng sự (2008) cũng chi ra rằng B. subtilis tiết ra hợp chat đối
kháng với A. hydrophila và Pseudomonas fluorescens. Nam 2012, Ran và cộng sự đã
chứng minh probiotic (Bacillus spp.) có tác dung tăng cường tỉ lệ sống cá nheo Mỹ và cá tra với tỉ lệ bảo hộ đạt 13,5% - 15,2% đối với cá nheo Mỹ và 19,6% - 86,3% đối với cá tra sau khi gây nhiễm với Ƒ. ictaluri. Do vậy, vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng
ức chê vi khuân gây bệnh xuât huyết trên cá tra.
34