DANH SÁCH CÁC BANG
CHUONG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khao sát thành phan hóa thực vật của Hải châu
4.1.1. Vật liệu
Mẫu thân lá cây sau khi thu được rửa sạch, sấy mẫu ở 55°C. Tiếp theo xay nhỏ thành bột và rây qua rây có đường kính 1 mm trước khi tiến hành các thí nghiệm. Mục dich của việc say khô là dé bảo quản lâu dài, tránh trường hợp bột bi hư hỏng ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Quá trình xay mẫu giúp tăng tông diện tích bề mặt tiếp xúc của
mẫu Hải châu với dung môi chiết, tăng hiệu suất chiết.
4.1.2. Định tính sự hiện diện một số hợp chất trong cây Hải châu
Thí nghiệm định tính nhằm khảo sát sự có mặt của một số nhóm hợp chất trong cây Hải châu. Kết quả thí nghiệm được trình trong Bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả định tính một số hợp chất trong thân lá cây Hải châu
Nhóm hợp chất Thuốc thử/Phản ứng Kết quả
Polyphenol FeCl; 5% + Tanin FeCl; 10% = Alkaloid Wagner + Saponin Tao bot bén ab
Flavonoid NaNO? 15% + AICH: 10% + NaOH 4% +
+: Phan ứng dương tính; —: Phan ứng âm tính.
21
Kết qua thí nghiệm định tính được thể hiện từ Hình 4.2 đến Hình 4.6
a b a b a b
Hình 4.7. Định tính Hình 4.8. Định tính Hình 4.8. Định tính Polyphenol. (a) Thi Tanin. (a) Thí nghiệm; Alkaloid. (a) Thí nghiệm;
nghiém, (b) Doi chứng. (b) Đối chứng. (b) Đối chứng.
a b a b Hình 4.4. Định tính Saponin. Hình 4.4. Dinh tính (a) Thí nghiệm; (b) Thí nghiệm Flavonoid. (a) Thí sau 60 phiit. nghiém; (b) Doi chúng.
Trong phan ứng định tinh polyphenol bang FeCl; 5% ở Hình 4.2, vi polyphenol chứa nhóm hydroxyl (OH) trong cấu trúc phân tử, nhóm OH này có kha năng tạo liên kết hydrogen với các nguyên tử hoá trị không đầy đủ, bao gồm nguyên tử sắt (Fe) trong FeCl:. Khi polyphenol phản ứng với FeCls, nguyên tử sắt trong FeCls sẽ tạo liên kết hydrogen với nhóm OH của polyphenol. Quá trình này tạo ra một phức chất màu xanh đen, nên khi dung dịch thí nghiệm chuyển sang màu xanh den thì chứng tỏ trong cây có
chứa polyphenol.
Khi định tính tanin bằng FeCl; ở Hình 4.3, thì dung dịch chuyên sang màu nâu, chứng tỏ trong cây Hải châu không có tanin, nêu dung dịch có màu xanh lục hoặc xanh
đen thì trong cây có chứa tanin.
Định tính alkaloid bằng thuốc thử Wagner, dịch chiết Hải châu sau cô cắn và hòa tan cắn trong dung dịch acid HCI 5% thì nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào ống nghiệm
22
thấy dich chiết có xuất hiện tủa màu nâu, chứng tỏ dịch chiết dương tính với alkaloid, kết qua thé hiện ở Hình 4.4.
Saponin được định tính bằng phản ứng tạo bọt. Phân tử saponin lớn, có một đầu ưa nước và một đầu ky nước nên khi cho nước vào địch chiết và lắc mạnh theo chiều đọc trong vòng một phút thì sẽ tạo bọt bền kết quả ở Hình 4.5.
Sử dụng phương pháp hiện màu với AICI; trong môi trường kiềm (NaOH) ở Hình 4.6, dé định tính flavonoid. Sau khi cho dịch chiết lần lượt phản ứng với NaNOs, AICI 10% và NaOH 4% thì ống nghiệm có xuất hiện màu cam, chứng tỏ trong cây Hải châu
có chứa flavonoid.
Từ kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy trong thân, lá cây Hải châu có sự hiện diện của 4 trên 5 nhóm hợp chất thực hiện định tính đó là: polyphenol, flavonoid, saponin, alkaloid và không chứa tanin. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu khảo sát thành phần hóa thực vật trên mẫu dịch chiết cây Hai châu của Chintalapani và ctv vào năm 2018 cũng cho ra kết quả định tính có polyphenol, flavonoid, saponin, alkaloid và không có tanin.
Theo báo cáo của Lattanzio vào năm 2013, Polyphenol thực vật được coi là có vai
trò chính như các hợp chất bảo vệ cây khi chịu áp lực từ môi trường sống, chăng hạn như thiếu chất dinh dưỡng. Mặt khác theo nghiên cứu của Poli và ctv năm 2019, thành phần nước nuôi tôm thẻ chân trắng chủ yếu là nitơ và photpho. Môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng không có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và có độ mặn khắc nghiệt nên polyphenol được chọn thực hiện thí nghiệm định lượng nhằm xác định sự tích lũy hợp chat trong cây khi thay đổi môi trường sống. Mặt khác, năm 2016 Sangeetha và ctv đã công bố rang flavonoid có tác dụng chống oxy hóa, an thần, chống tram cảm, chống viêm, chống vi khuẩn, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, và nhiều giá trị được liệu khác nên flavonoid là chất thứ hai được chọn đề thực hiện định lượng. Thêm vào đó, từ kết quả định tinh sự hiện điện một số hợp chất trong cây Hải châu cho thay sự hiện điện của polyphenol và flavonoid trong mẫu Hải châu tạo tiền đề cho thí nghiệm xác định hàm hượng polyphenol và flavonoid trong nội dung tiếp theo.
23
4.2. Khảo sát sự sinh trưởng và tích lũy polyphenol, flavonoid trong cây Hải chau
trồng ở môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng và môi trường thủy canh
Masterblend
4.2.1. Khảo sát sự sinh trưởng của cây
Sau 30 ngày khảo sát các chỉ tiêu chiều cao cây, khối lượng tươi và khối lượng
khô của cây được trình bày ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát sinh trưởng của cây Hải châu trồng ở môi trường TC và môi
trường TT
Nghiệm thức Chiều cao (em) Khối lượng tươi(g) Khối lượng khô (g)
NTI 30,70" + 0,164 917,2*+ 36,8 71,54? + 2,87
NT2 24,07° + 0,208 663,1° + 27,2 53,05" + 2,18 Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thong kê. (p<0,05).
Qua két qua 6 Bang 4.2 cho thay:
Xét về chiều cao cây ở môi trường TC là 30,70 cm cao hơn gấp 1,3 lần so với chiều cao trung bình cây ở môi trường TT. Kết quả này có thé là do môi trường TT có độ mặn cao và có ít thành phần dinh dưỡng hơn nên cây sinh trưởng và phát triển kém
hơn so với cây ở môi trường TC. Theo nghiên cứu của Ali năm 2011, thì độ mặn là tác
nhân phi sinh học gây ức chế sự tăng trưởng của cây trồng.
Xét về khối lượng tươi và khối lượng khô sau 30 ngày bố trí thí nghiệm, cây trồng ở nghiệm thức thủy canh Masterblend có khối lượng tươi (917,2 g) cao hơn gap 1,4 lần so với cây trồng ở môi trường nước nuôi tôm (663,1 g). Khối lượng khô ở nghiệm thức thủy canh (71,54 g) cao hơn gấp 1,3 lần so với khối lượng khô trồng ở nghiệm thức nước nuôi tôm (53,05 g). Từ kết quả số liệu khối lượng tươi và khối lượng khô kết luận cây trồng ở môi trường TC cao hơn cây trồng ở môi trường TT, kết quả nay phù hợp với nghiên cứu của Dolatabadian và ctv năm 2011, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu thì cho kết quả giảm đáng kể trọng lượng tươi và trọng lượng khô, chiều cao cây và số lá.
Từ kết quả khối lượng tươi và khối lượng khô có được số liệu sau: cứ 1 g mẫu Hải châu tươi ở môi trường TC sau khi sấy thu được 78 mg mẫu khô và ở môi trường TT là 80 mg mẫu khô. Từ đó cho thấy khối lượng khô trên một gam mẫu tươi ở môi
trường TT cao hơn ở môi trường TC, chứng tỏ lượng nước tích lũy trong cây Hải châu
24
ở môi trường TC cao hơn. Theo Kader và ctv 2010, thực vật có khả năng hấp thụ nước và khoáng chất thiết yếu vì chúng có áp suất nước cao hơn so với môi trường sống bình thường. Khi stress mặn xảy ra, áp suất thâm thấu của dung dịch bên ngoài lớn hơn trong tế bào thực vật. Do đó khả năng hấp thụ nước kém hơn.
4.2.2. Khao sat sự tích liiy polyphenol va flavonoid trong cây Hải chau Xử ly mẫu ở hai nghiệm thức
Độ ẩm bột, hiệu suất chiết và độ âm cao chiết cua mau Hai chau trồng ở hai môi
trường thí nghiệm được thê hiện trong Bảng 4.3.
Bảng 4.3. Độ am bột, hiệu suất chiết và độ âm cao chiết của mẫu cây Hải châu ở hai
nghiệm thức
Mẫu Độ âm bột Hiệu suất chiết Độ âm cao chiết
Hải châu — TC 6? + 0,00 17,734 + 0,94 5,69 + 0,29 Hải châu — TT 67+ 0,58 18,43* + 1,20 5,50* + 0,38 Trong cùng mot cội. các giá tri trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt
thông kê (P<0,05).
Từ Bang 4.3 cho thấy hai mẫu bột đều có độ 4m là 6% nhỏ hơn 13%, phù hợp với tiêu chuẩn dược liệu của bộ y tế ban hành năm 2011. Khi so sánh với độ 4m của Rau dang đất (Glunus oppositifolius (L.)) là 7,74% (Nguyễn Thị Thu Hiền va ctv, 2020) thì độ âm mẫu bột Hai châu thấp hơn 1,3 lần. Độ âm của mẫu dược liệu càng thấp thì thời gian bảo quản càng lâu, đồng thời hạn chế sự hoạt động của các vi sinh vật phân giải hoặc nắm gây hư hại làm biến tính dược liệu.
25
Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất cao chiết thu được từ hai mẫu không có sự khác biệt có ý nghĩa, hiệu suất chiết lần lượt là 18,78% đối với Hải châu — TC, 18,43%
đối với Hải châu — TT. Cả hai mẫu đều có hiệu suất chiết cao hơn 15% phù hợp với tiêu chuẩn của dược điển Việt Nam V. Khi đem hiệu suất chiết của Hải châu so sánh với hiệu suất chiết của Bông 6i (Lantana camara L.) là 12,36% và Chân voi mềm (Elephantopus mollis Kunth) là 15,15% (Phạm Minh Nhật va ctv, 2019), có thé thay hiệu suất chiết Hải châu khá cao. Qua đó cho thay phương pháp chiết dang dùng kha
hiệu quả và phù hợp với Hải châu.
Cao chiết cây Hai châu là khối đặc quánh, với độ 4m cao chiết Hải châu ở môi trường TC là 5,69%, ở môi trường TT là 5,50%, cả 2 độ âm đều dưới 20%, phù hợp với tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam V ban hành năm 2011. Khi so với độ âm cao chiết của Xuyên tâm liên 14 19,79% ( Nguyễn Văn Thắng và Đỗ Công Ba, 2022) thì độ 4m cao chiết của Hải châu thấp hơn đáng kể.
Hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết mẫu được tính toán thông qua đường chuẩn galic acid, với nồng độ lần lượt từ 20 - 100 ug/mL bang phản ứng hiện mau với thuốc thử Folin — Ciocalteu. Kết quả xây dựng phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ gallic acid với nồng độ hấp thu quang ở bước sóng 765 nm
được trình bày trong Bảng 4.4 và Hình 4.9:
Bảng 4.4. Tương quan giữa nồng độ gallic acid và độ hấp thu
Nông độ(ugmL) 20 40 60 80 100
ABS 756nm 0,169 — 0.354 0,492 0,635 0,840
Phương trình đường chuẩn: y = 0,0081x + 0,0111 R7 = 0,9950
26
Đường chuẩn gallic acid (ug/mL)
0,9
08 y=0.0081x + 0.0111 ad
of 0,7 R? = 0.995 igs
S 06 8
= 05 i
Zo ae
& 03 “
= 02 :
©- °a 01
0
0 20 40 60 80 100 120
Nong độ gallic acid (ug/mL)
Hình 4.12. Đường chuẩn gallic acid (20 — 100 g/mL).
Độ hap thụ quang và nồng độ của dung dich chất chuẩn gallic acid có tương quan tuyến tính chặt chẽ với hệ số tương quan R? = 0,9950 và phương trình hồi quy tuyến tính là y = 0,0081x + 0,0111. Trong đó y là độ hấp thụ quang ở bước sóng 765 nm, x là nồng độ của dung dịch chuẩn gallic acid (ug/mL).
Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn gallic acid và công
thức tính được hàm lượng polyphenol TPC (mgGAE/g).
Bảng 4.5. Kết quả hàm lượng Polyphenol của mẫu ở hai môi trường thí nghiệm Mẫu Hai châu — TC Hai chau — TT
Hàm lượng polyphenol "
: he 3,822 +
(mgGAE/g) 54,02 + 0,42 63,822 + 1,52
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt vỀ mặt
thông kê (P<0,05).
Kết qua từ bang 4.5 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số thu được từ dịch chiết cồn 70% của mẫu Hai châu ở hai nghiệm thức lần lượt là: trong 1 g mẫu khô Hải châu trồng ở môi trường nước nuôi tôm có hàm lượng polyphenol là 63,82 mgGAE/g cao gap 1,2 lần so với hàm lượng polyphenol trong 1 g mẫu khô Hải châu trồng ở môi
trường thuỷ canh là 54,02 mgGAE/g. Tương tự như nghiên cứu định lượng polyphenol
của Chintalapani và ctv vào năm 2018, nghiên cứu này cho kết quả hàm lượng
polyphenol của cây Hải châu là 54,05 mgGAE/g.
27
Thực vật phát triển trong môi trường căng thắng có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất polyphenol hơn so với thực vật phát triển trong điều kiện bình thường (Selmar, 2008). Theo kết quả nghiên cứu của Slama và ctv năm 2017, về ảnh hưởng của độ mặn đến sự tích lũy polyphenol với độ mặn là 200 mM thì cây tích lũy được lượng polyphenol cao hơn so với các nồng độ muối còn lại là 0, 400, 600, 800 Mm (TPC của mẫu cây ở nồng độ NaCl 200 mM cao hơn 40% so với đối chứng). Với độ mặn 200 mM tương đương với độ mặn là 11,7%o, nằm trong khoảng độ mặn dao động của nước nuôi tôm.
Theo Trần Viết Mỹ năm 2009, độ mặn nước nuôi tôm thẻ chân trắng thích hợp thường
giao động khoảng 7 - 34%o.
Từ kết quả thí nghiệm đạt được so sánh với các nghiên cứu khác về hàm lượng polyphenol thì: TPC của Hải châu trồng trên môi trường TT (63,82 mgGAE/g) cao gấp 3,5 lần TPC của Oải hương (Lavandula angustifolia) (18,1 mgGAE/g) và cao hơn 1,3 lần TPC của Hing lui (Mentha spicata) (47,6 mgGAE/g) trong báo cáo nghiên cứu của
Tawaha và ctv, 2007.
Hàm lượng flavonoid
Kết quả xây dựng phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ quercetin với độ hấp thụ quang ở bước sóng 415 nm từ đường chuẩn quercetin ở dãy nồng độ
20 — 100 ug/mL được trình bày trong Bang 4.6 và Hình 4.10:
Bảng 4.6. Tương quan giữa nồng độ quercetin và độ hấp thu
Nong độ (g/mL) 20 40 60 80 100
ABS 415 nm 0,147 0,303 0,456 0,629 0,800
Phương trình đường chuẩn: y = 0,0082x — 0,0226 R2 = 0,9992
28
Đường chuẩn Quercetin (ug/mL)
0,9
0,8 °
2 07 y = 0.0082x - 0.0226 i ng R? = 0.9992 se
2 lở @
a 0,4 5
`& `
= 0,3 we
<O- `.
0,2 Ps
“
0,1 0
0 20 40 60 80 100 120
Nông độ Quercetin (ug/mL)
Hình 4.13. Đường chuẩn quercetin (20 — 100 g/mL).
Từ kết quả trình bày trong Bảng 4.6 và Hình 4.10, ta có được phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b thé hiện mối tương quan giữa nồng độ quercetin với độ hấp thụ quang ở bước sóng 415 nm là: y = 0,0082x — 0,0226. Trong đó, y là giá trị đo độ hap thụ quang ở bước sóng 415 nm, x là nồng độ quercetin (ug/mL). Từ phương trình đường chuẩn đã xây dựng, ta xác định được hàm lượng flavonoid có trong mẫu dịch chiết Hải châu ở hai nghiệm thức. Kết quả định lượng flavonoid được trình bày trong
Bảng 4.7:
Bảng 4.7. Kết quả hàm lượng flavonoid của mẫu ở hai môi trường thí nghiệm Mẫu Hải châu — TC Hải châu — TT Hàm lượng flavonoid (mgQE/g) 47,53°+ 0,22 53,01" 4022
Trong cùng mot cột, các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mat thông kê (P<0,05).
Kết quả hàm lượng flavonoid từ Bảng 4.7: trong 1 g mẫu Hải châu trồng ở môi trường TT có hàm lượng flavonoid là 53,01 mgQE/g cao gấp 1,1 lần so với hàm lượng flavonoid trong 1 g mẫu Hải châu trồng ở môi trường TC là 47,53 mgQE/g. Từ đó kết
luận, hàm lượng flavonoid của cây ở môi trường TT cao hon môi trường TC. Tương tự
như kết quả nghiên cứu của Chintalapani và ctv vào năm 2018, cho kết quả định lượng flavonoid là 24,60 mgQE/g từ đó cho thay lượng flavonoid tích lũy trong cây Hải châu ở hai môi trường thí nghiệm là cao hơn, có thé là do sự khác biệt về môi trường và phương pháp chiết ảnh hưởng đến hàm lượng chất tích lũy trong cây.
29
Khi so sánh với hàm lượng flavonoid có trong Mông tơi (Basella alba) TFC =
6,97 mgQE/g (Aryal và ctv, 2019), Rau sam (Portulaca aleracea L.) TFC = 56,2 mgQE/g (Habibian va ctv, 2020) thi ham lượng flavonoid tích lũy trong cây Hải chau
được trồng trong môi trường TT cao gấp 7,6 lần Mông tơi, gần xap xi TFC của rau sam.
Theo kết quả định lượng 2 nhóm hợp chất polyphenol và flavonoid thì cây ở môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng có lượng hợp chất tích lũy cao hơn so với môi trường thủy canh Masterblend. Ở môi trường TT cây Hải châu có xu hướng tích lũy nhiều polyphenol hơn. Theo nghiên cứu của Cheynier và ctv vào năm 2013, khi chịu áp lực của môi trường sống thực vật có đặc điểm chung là tích lũy nhiều polyphenol hơn, dé thực hiện cơ chế phòng thủ và đối phó với các căng thang phi sinh học. Theo công bố của Sharma và ctv vào năm 2019, polyphenol thực vật đóng vai trò quan trọng trong một số quá trình sinh ly dé cải thiện khả năng chống chịu và khả năng thích ứng của thực vật trong điều kiện dưới mức tối ưu như độ mặn, kim loại nặng, hạn hán, nhiệt độ....
Đồng thời, lượng flavonoid trong cây ở môi trường nước nuôi tôm cũng cao hơn ở môi trường thủy canh Masterblend. Vì theo Agati và ctv (2011) khi vùng rễ cây chịu ảnh hưởng của độ mặn thì giúp cây tăng cường sinh tông hợp flavonoid.
4.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cây Hải châu trồng ở môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng và môi trường thủy canh Masterblend
Sử dụng dung dịch cao chiết có nồng độ 350 mg/mL trong dung dich DMSO lên hai đối tượng vi khuẩn E. coli và S. aureus. Đôi chứng âm là dung dich DMSO và đối chứng dương là đĩa giấy kháng sinh Amoxicillin 0,1%. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thử.
Bảng 4.8. Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Đối tượng cong Cao chiết Hải Cao chiết Hải
DMSO (-) Amoxicillin 0,1% (+) chau TC châu —M= 0
E. coli - 28,677 + 0,67 - -
S. aureus 2 40,334 + 1,20 10° + 0,58 8,67° + 0,33 (Đường kính vòng kháng khuẩn bao gồm cả đường kính dia giấy — 6 mm).
30
Hình 4.14. Khảo sát đường kính vòng khang khuẩn trên E. coli và S. aureus.
(+): Đối chứng dương Amoxicillin 0,1%; (—): Đối chứng âm DMSO; (TC): Dịch chiết thân lá cây Hải châu trong môi trường thủy canh Masterblend; (M): Dịch chiết thân lá
cây Hải châu trong môi trường nước nuôi tôm.
Từ kêt quả Bảng 4.8 và Hình 4.11 cho thay, dung dịch cao chiét có nông độ 350
mg/mL của cây Hải châu ở cả hai môi trường thí nghiệm không thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với E. coli và có khả năng kháng khuẩn đối với S. aureus. Đường kính vòng kháng khuẩn ở dung dịch cao chiết của Hải châu ở môi trường thủy canh Masterblend là 10,00 mm, còn đường kính vòng kháng khuẩn của dung dịch cao chiết cây Hải châu
ở môi trường nước nuôi tôm là 8,67 mm.
Kết quả khảo sát cho thấy với nồng độ 350 mg/mL cao chiết của mẫu Hải châu ở hai môi trường thí nghiệm đều kháng lại vi khuan Staphylococcus aureus. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Al-Azzawi và ctv năm 2012, cho kết quả mẫu dịch chiết
trên cây hải châu khang lại S.aureus.
Mặt khác, đối với chủng Ƒ. coli cả hai mẫu đều không thể hiện khả năng kháng khuẩn, khác với nghiên cứu trước đó của Al-Azzawi và ctv (2012) cho kết quả cao chiết Hải châu có khả năng kháng lại vi khuan E. coli.
Đồng thời, có thé là do phương pháp chiết va dung môi được sử dung dé ly trích chưa được tối ưu, cho nên hàm lượng các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như các hợp chất thuộc nhóm terpenoid (Griffin và ctv, 1999) thu được không đủ đề thê hiện
31