DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Dia điểm thực hiện
Nghiên cứu được thực hiện từ thang 03 năm 2023 tại phòng Bio309 (Phòng nghiên cứu Dược liệu và Cây dược liệu), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm
Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mau lá tre của cây 5 năm tuổi được thu hái tại Thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương. Mẫu được thu tươi sau đó rửa sạch và đề ráo.
3.2.1.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu được thu hái là lá tre tươi, lá còn nguyên, bỏ cuống, loại bỏ lá sâu, vàng úa, đốm den, rửa sạch, cắt nhỏ (đài 2 — 3 cm; rộng lem) và xay mịn (sàng qua ray 1 mm).
Bảo quản trong túi nilon màu đen, sử dụng trong ngày.
3.2.1.2. Xác định hàm lượng nước của mẫu lá tre
Cân khối lượng cốc sứ và nắp, đem đi sấy ở 105°C trong 30 phút, đặt vào bình hút âm làm nguội đến nhiệt độ phòng. Cân 1 g chính xác đến 0,01 g cho vào cốc sứ đã được say khô và cân trước đó. Dem đi say ở nhiệt độ 55°C trong 2 - 5 giờ, làm nguội trong bình hút 4m đến nhiệt độ phòng và sau đó cân chính xác đến 0,01 g. Lap lại các thao tác gia nhiệt, làm nguội và cân cho đến khi hao hụt khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không đổi. Thực hiện cho cả mẫu cắt và mẫu xay, mỗi mẫu 3 lần lặp lại (Dược điển Việt Nam
V - Tập 2, 2017).
m1—-m2
W(%)= x 100
m1— m0
Trong đó:
W là hàm lượng nước (%)
mo là khối lượng của cốc và nắp đã được sấy (g)
my là khối lượng của cốc, nắp cùng với phan mẫu trước khi sấy (g) ma là khối lượng của cốc, nắp cùng với phần mẫu sau khi sấy (g).
3.2.2. Quy trình chưng cất tỉnh dầu
Chiết xuất tinh dầu lá tre bằng phương pháp chưng cat hơi nước (Liu va ctv, 2018).
Tiến hành tách chiết tinh dầu trong 6 giờ, mỗi loại mẫu thực hiện 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 500 g mẫu. Xác định hàm lượng tinh dầu của mẫu tươi bang công thức:
12
Hra= hs 100mtd
Trong do:
Hwa là hàm lượng tinh dầu (mg/100g)
mea là khối lượng tinh dau sau khi tách chiết (mg) ma là khối lượng mẫu ban đầu (g).
eae TTT
—— TTI IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII|
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII|
„¡WIIIIIIIIIIIIIIIIIIII| |,
“TIIIIIIIIIIIIIIIII|||
+) IfIIIHIIIIIIIII|Iois
\ M.
Hình 3.1. Bộ tach chiết tinh dau. (a) Thiét bi diéu nhiệt = lạnh tuân hoàn; (b) Bép hồng ngoại; (c) Nồi; (d) Nhan tach; (e) Ong sinh han.
13
Sau khi chưng cất hơi nước, tiến hành thu nhận tinh dau lá tre và chứa trong bình thủy tinh, bao quản 5°C. Loại bỏ phan nước còn sót có trong tinh dầu bang hạt hút âm để thu được tinh dầu nguyên chất không lẫn nước.
Dé có mối tương quan về hàm lượng tinh dau giữ lá tre tươi và khô cũng như giữa lý thuyết và thực tiễn. Tiến hành xác định hàm lượng tinh dau lá tươi của mẫu khô về mặt lí thuyết bằng công thức:
mt“ _.100
1“
Trong đó: Ha là hàm lượng tinh dầu của mẫu khô.
3.2.3. Khảo sát mang tính định tính thành phần các hợp chat trong tinh dầu lá tre 3.2.3.1. Phân tách các chất bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Mẫu được phân tích là mẫu tinh đầu nguyên chất đã được loại bỏ nước hay
hydrosol.
Tiến hành thực hiện:
Bình giải ly: Cho dung môi ethylacetate (141-78-6, Merck) và toluen (108-88-3,
Xilong) vào bình với tỉ lệ 1:19, để hơi đung môi hòa điều trong bình giải ly khoảng 30
phút.
Thuốc thử: Hòa tan 1 g vanilline (121-33-5, Acros Organics) trong 100 ml ethanol 95° (64-17-5, Cemaco), để trên nước đá. Sau đó, cho vào 2 ml HaSOx dam đặc (7664-
93-9, Xilong).
Pha mau: 0,05 g tinh dau lá tre pha trong 0,5 ml điethyleter (60-29-7, Xilong).
Cách tiến hành:
Sử dụng micropipet hút chất cần kiểm tra vào bản mỏng, mỗi vết chấm phải nhỏ, gon 2 — 3 mm, tránh chạm tay vào bản mỏng va không làm rach bản mỏng. Vết cham cách mặt đáy 2 cm, vết này cách vết kia 2 cm và cách bờ cạnh của bản mỏng 1,5 cm.
Nhỏ tinh dầu lên bản mỏng với thé tích lần lượt: 10 pL; 20 uL; 10 pL; 20 WL. Dé các vết châm trên bảng mỏng khô, nhúng bản mỏng vào bình giải ly thật nhẹ nhàng, không dé nghiêng bản mỏng, dap nắp kín. Lưu ý, trong thời gian này không di chuyển bình.
Mao quản trong bình sẽ dẫn chất đi lên, theo dỗi mức dung môi di chuyển đến đầu trên bản mỏng khoảng 3 - 4 cm, lay bản mỏng ra.
Dé dung môi trên bản mỏng khô. Phun thuốc thử lên bản mỏng, phát hiện vết ở
105°C trong 5 phút. Thực hiện một bản mỏng khác với thao tác tương tự và thực hiện 9
14
mẫu với thé tích 20 uL, không phun thuốc thử, thực hiện soi đèn UV 256 nm dé quan sat các chất được tách thành các dai. Quan sát va cạo vết ở vị trí có Re= 0,6 và Re= 0,5.
3.2.3.2. Xác định các chất bằng phương pháp sắc ký khối phố (GC-MS)
Mau phân tích bao gồm tinh dau lá tre nguyên chất và 2 mẫu cạo vết silica gel lay từ mục 3.2.3.1 và tiễn hành phân tích GC-MS.
Pha mẫu:
Mau tinh dầu gốc: Cân 0,1 g tinh dau pha vào 2 mL dung dich methanol (67-56-1, Xilong), vortex cho đồng nhất.
Mau cạo vết: Cho mỗi mẫu cạo vết vào 2 mL methanol, vortex cho đông nhât. Lọc
Hình 3.2. Hệ thống máy phân tích GC-MS trong phòng thí nghiệm.
3.2.4. Đánh giá khả năng chống oxy hóa
Đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp thử nghiệm DPPH. Đối chứng dương được sử dụng là axit ascorbic. Các mẫu thử và đối chứng dương được tiến
15
hành khảo sát ở 5 nồng độ khác nhau (5 pL; 10 wL; 15 wL; 20 pL ; 25 pL) cùng với 1 mẫu đối chứng âm và 1 mẫu blank.
3.2.4.1. Pha dung dịch DPPH 0,5 mM
Can chính xác 0,02 g DPPH (1898-66-4, Alfa) thêm methanol vừa đủ 100 mL vào
cốc dong đã được quan giấy bac xung quanh, khuấy cho đến khi DPPH tan hoàn toàn, đậy kín bằng giấy bạc, bảo quản ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong 2 giờ.
3.2.4.2. Pha dung dịch chuẩn axit ascorbic 100 pg/mL
Cân chính xác 0,01 g axit ascorbic (50-81-7, SRL) thêm nước cất cho vừa đủ 100 mL vào bình chứa thủy tỉnh, khuấy đều đến khi axit ascorbic tan hoàn toàn. Bảo quản ở
nhiệt độ 5°C.
3.2.4.3. Chuẩn bị dung dịch tinh dầu 100 pg/mL
Cân chính xác 0,01 g tinh dau lá tre, cho thêm côn tuyệt đối cho vừa đủ 100 mL vào bình chứa thủy tinh, đậy nap, lắc đều đến khi tinh dầu tan hết. Bảo quan ở nhiệt độ
5°C và tránh sáng.
3.2.4.4. Xây đựng đường chuẩn axit ascorbic
Xây dựng đường chuẩn axit ascorbic dé so sánh kha năng chống oxy hóa với tinh dau lá tre. Thành phần hóa chat được thé hiện như Bảng 3.1, thực hiên 3 lần lặp lại.
Bang 3.1. Bảng thành phần hóa chất phản ứng thử nghiệm DPPH trên axit ascorbic Ongnghiém Blank Đối 1 5 3 4 5 Hóa chất chứng
Néng độ axit ascorbic 0 0 5 10 15 20 25 (ug/mL)
Axit ascorbic 100 pg/mL 0 0 73 150 225 300 375
(uL)
Nước cất (uL) 0 1500 1425 1350 1275 1200 1125 DPPH 0,5 mM (uL) 0 1500 1500 1500 1500 1500 1500
Methanol (uL) 3000 0 0 0 0 0 0 Tat cả các mau phải thực hiện trong cùng một điêu kiện và ở điều kiện tối trong quá trình
thực hiện dé tránh sự ảnh hưởng của ánh sáng lên dung dich DPPH.
16
3.2.4.5. Đánh giả khả năng chống oxy hóa của tỉnh dầu lá tre bằng phương pháp
thử nghiệm DPPH
Xây dựng đường biểu đồ thé hiện khả năng chống oxy hóa của tinh dau lá tre để đánh giá khả năng chống oxy hóa. Thực hiện 3 lần lặp lại.
Bang 3.2. Bảng thành phần hóa chat phản ứng thử nghiệm DPPH trên tinh dau lá tre Ông nghiệm Blank Đối 1 2 3 4 5 Hóa chất chứng
Nông độ tinh dâu (g/mL) 0 0 5 10 15 20 25 Tinh dầu 100 pg/mL (ul) — 0 0 75 150 225 300 375
Ethanol (uL) 0 1500 1425 1350 1275 1200 1125 DPPH 0,5 mM (uL) 0 1500 1500 1500 1500 1500 1500 Methanol (HL) 3000 0 0 0 0 0 0
Tắt cả các mẫu phải thực hiện trong cùng một diéu kiện và ở điều kiện tối trong quá trình
thực hiện dé tránh sự ảnh hưởng của ánh sáng lên dung dich DPPH.
3.2.4.6 Cách tính kết quả
Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) được tính theo công thức:
ODc —- ODt + Dc
HTCO (%) = 100 Trong do:
ODe : Mật độ quang của mẫu đối chứng âm
ODt : Mật độ quang của dung dịch DPPH và mẫu thử
Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu phân tích bằng phần mềm Excel ta được phương trình thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ mẫu thử và HTCO (%) có dạng y = a(x) + b, thế y = 50 dé suy ra ICso (kha năng đánh bắt 50% DPPH của mẫu). Giá trị ICso càng thấp tương ứng với HTCO cảng cao và ngược lại. Số liệu kết quả thí nghiệm được tính trung bình của 3 lần đo khác nhau.
17