DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thu hái và xử lí lá tre
Cây tre mỡ được người dân tỉnh Bình Dương trồng từ bao đời (Hình 4.1), cây tre được dùng dé làm làm các công trình như cột, giằng mái, hàng rào, chồi. Các sản phẩm sử dụng bằng tre như: ré tre, manh tre, thing tre, met tre, chiếu tre. Hiện tại, với sự phát triển kinh tế người dân dùng tre đề trang trí cảnh quan, làm hảng rào.
Lá tre được thu hái tươi, sau khi rửa sạch, cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn và lọc qua rây 1 mm thu được nguyên liệu ở dạng cắt nhỏ/xay mịn có kích thước tối đa 1 mm. Mẫu lá
tre cat nhỏ và bột lá tre có màu xanh, mùi thơm nhẹ.
18
Hình 4.2. Lá tre cắt nhỏ. (a) Lá tre cắt nhỏ; (b) Chiêu rộng lá tre; (c) Chiêu dai
lá tre).
4.2. Kết quả xác định hàm lượng nước và tinh dầu
Sau khi thực hiện xác định hàm lượng nước và chưng cất, xác định hàm lượng tinh dầu, tiến hành xử lí thống kê. Kết quả được ghi nhận ở Bảng 4.1.
Bang 4.1. Bảng chỉ tiêu hàm lượng nước và tinh dầu
Stt Mau Ham luong Ham lượng tinh dau Hàm lương tinh dau
nước (%) (mg/100g mau tuoi) (mg/100g mau khô)
1 Catnhd 50,33 + 1,15 4,67 + 1,15 10,77 + 2,54
2 Xay 24,67 + 0,58 14,67 + 4,62 19,50 + 6,24
3 chỉ tiêu hàm lượng trên được thể hiện dưới dang trung bình của 3 lan lặp lai + SE tinh
băng phương pháp t-Test 2 nhân to của phan mém Minitab 16.
Kết quả thực hiện cho thấy hàm lượng nước ở mẫu lá tre tương đối thấp chiếm 50,33 + 1,15 % ở mẫu cắt, một phần nước trong lá tre sẽ được bay hơi trong quá trình
19
xay nên hàm lượng nước giảm từ 50,33 + 1,15 % xuống 24,67 + 0,58 % ở mẫu xay mịn.
Ở mẫu lá tre tươi, tinh dầu ở mẫu xay cao gấp 3 lần so với mẫu cắt do xay mẫu làm cho tế bào chứa tinh dau bị vỡ ra nên thu được nhiều tinh dầu hơn. Ở mẫu lá tre khô, ham lượng tinh dau thu được từ mẫu xay cao hơn 2 lần so với mẫu cắt do sự khác nhau về kích thước của hai loại mẫu.
4.3. Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng
Dựa vào nguyên lí hoạt động của phương pháp sắc ký lớp mỏng, các hợp chất trong tinh dau dé dàng được tách và hiện màu trên bản mỏng. Khi soi đèn UV 256 nm thấy có các vết màu tím và xanh dương xuất hiện (Hình 4.5).
20
Vết 2 Vết 2 Vét 1 Vết 1
Hình 4.5. Bản mỏng dưới đèn UV 256 Hình 4.6. Bản mong hiện mau
nm (a) 10wL; (b) 20uL; (c) 10 pL; (đ)20 bằng vanilin/H›SOu. (a) 10uL; (b)
uL. 20uL; (c) 10 uL; (d)20 wL.
Thông qua bản mỏng (Hình 4.6), bước đầu thử nghiệm xác định hợp chat từ hai vết. Vết 1 (Ra= 0,5) có màu tím và điện tích lớn nhất. Vết 2 (Rp = 0,6) có màu tim nhạt. Theo (Kristanti and Tunjung 2015) khi sử dụng phương pháp TLC với thuốc thử vanilin/H2SO, tao mau tim cho terpenoid. Tiến hành cạo 2 vết bản mỏng và xác định hợp chat từ hai vét trên bằng phương pháp GC-MS.
4.4. Kết qua phân tích sắc ký khối phé
Từ kết quả của phân tích sắc ký khối phổ, nhận thấy có 8 chất được xác định, thuộc
nhóm terpenoid (a-Ionone, trans-B-lonone, Hexahydrofarnesyl acetone, Farnesyl
acetone, Phytol), axit béo (Palmatic acid), este (Hexadecanoic acid, ethyl ester; 9,12,15- Octadecatrienoic acid, ethyl ester, (Z,Z,Z)-).
‘Abundance TIC: 230619_TreF4.Didata.ms
16.†28 1.2e+08
1e+08
8e+07 10.943
6e+07
13.639 4e+07
2e+07 14.179
4 hà bu W 2 17.288.877Ái 2
†
Time--> 100 200 3.00 400 500 600 700 800 900 10.00 11.00 1200 13.00 14.00 15.00 16.00 1700 1800 19.00 20.00 Abundance TIC: 230619_TreF4.D\data.ms
1e+08
Se+07
Time—> 200 3.00 400 500 600 700 800 9.00 1000 1100 1200 13.00 1400 15.00 1600 1700 18.00 19.00 20.00
Hình 4.7. Sắc ký đồ của mẫu tinh dau lá tre.
21
Bảng 4.2. Bảng thành phan các hoạt chất trong tinh dau lá tre
Stt Chất phát hiện Diện tích peak (%)
1 a-Ionone 1,09 2 trans-j-lonone 2,91 3 Hexahydrofarnesyl acetone 15,6 4 Farnesyl acetone 1,67 5 n-Hexadecanoic acid 20,63 6 Hexadecanoie acid, ethyl ester 3,99 ý Phytol 42.96 8 9,12,15-Octadecatrienoic acid, ethyl ester, 2,82
(Z,Z,Z)-
Abundance TIC: 230620_Tre_Fr1.D\data.ms seni 6e+07:
Se+07
4e+07.
3e+07
2e+07.
1e+07:
. mm. ...
Nhang 100 200 3.00 400 500 600 700 NH1 Hee ee 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00
6e+07:
4e+07:
2e+07:
Time--> 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 a Gia 1600 1600 1700 1800 1900 2000 Hình 4.8. Sắc ký đồ của vết cao 1.
Bang 4.3. Bảng thành phần các hoạt chat trong vết cạo 1
Stt Chat phat hién Dién tich peak (%) 1 n-Hexadecanoic acid 8,7
2 Phytol 91,3
‘Abundance TIC: 230620_Tre_Fr2.Didata. ms
3500000!
2500000)
4.786 2000000)
1500000:
1.487
1000000: 13.121
15.086,
14.793 250
3507 5.298 ae Ve er
Time--> 100 200 300 400 5.00 600 700 8.00 900 10.00 1100 1200 13.00 1400 1500 16.00 1700 1800 1900 20.00
‘Abundance TIC: 230620_Tre_Fr2.D\data ms
2000000)
1500000:
1000000:
“i "ơ...
T T T † T U TT T T T T T T T Time-.> 200 3.00 400 500 6.00 700 800 9.00 10.00 1100 1200 1300 14.00 15.00 16.00 1700 18.00 19.00 20.00
Hình 4.9. Sắc ký đồ của vết cạo 2.
22
Bảng 4.4. Bảng thành phần các hoạt chất trong vết cạo 2
Stt Chất phát hiện Diện tích peak (%)
1 Trans-B-Ionone 48,98 2 Isophytol 16,36
Két qua cao vết được thé hiện ở (Bảng 4.3) và (Bảng 4.4) nhận thây. Vét 1 chứa phytol va n-Hexadecanoic acid. Vết 2 chứa trans-B-Ionone và isophytol.
Như vay, phương pháp hiện màu với thuốc thử vanilin/H2SO, có khả năng phát
hiện sequiterpen và diterpenoid. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Nguyễn Phượng Vỹ và Nguyễn Trung Tính (2008), cũng có khả năng phát hiện monoterpenoid (menthol, menthone) bằng thuốc thử vanilin/HaSOu.
Từ kết quả phân tích GC-MS, phytol là hợp chất có diện tích peak cao nhất trong tinh dau (42,96%). Phytol là một phan tử có trong diép luc tố, được sử dụng rộng rãi như phụ gia thực phẩm và trong lĩnh vực y học. Theo nghiên cứu của Moraes va ctv,
2014, phytol có khả năng kháng Schistosoma mansoni (thử nghiệm in vitro trên chuột).
Phytol và các dẫn xuất của nó đã được chứng minh là có tác dụng kháng khuẩn, gây độc tế bào, chống ung thư, chống đột biến, chống quái thai, kháng sinh-hóa trị liệu, trị đái tháo đường, hạ lipid máu, chống co thắt, chống co giật, chống nôn, chống oxy hóa, chống viêm, chống tram cảm, hỗ trợ miễn dịch, hỗ trợ mọc tóc, chống rụng tóc và các hoạt động trị gàu. Mặt khác, chất chuyển hóa sinh học quan trọng cua phytol là axit phytanic, có hoạt tính gây độc tế bào, trị đái tháo đường, hạ lipid và chống ung thư
(Islam và ctv, 2015).
Tuy nhiên, trong nghiên cứu nay, isophytol không được tìm thấy trong tinh dầu lá tre nguyên chất. Isophytol được tìm thấy trong vết cạo thứ hai khi phân tích GC-MS có thé là do phytol đã chuyền hóa. Trên thực tế, có 4 nguyên nhân có thé làm cho phytol chuyền hóa thành isophytol bao gồm: Phản ứng xúc tác axit, phản ứng xúc tác kim loại, phản ứng sinh học (do vi sinh vật), phản ứng ở điều kiện nhiệt độ cao. (Changi và ctv, 2012). a-Ionone, trans-B-Ionones là hợp chất terpenoid được tìm thay trong tinh dau lá tre khi phân tích GC-MS. ơ-lonone, trans-B-Ionones là hợp chất được dùng rất nhiều trong lĩnh vực mỹ phẩm đặc biệt là nước hoa. a-Ionone là thành phan quan trọng của nước hoa Chanel No.5 nổi tiếng thế giới va cũng là mẫu nước hoa nỗi tiếng nhất của
hãng này.
23
4.5. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH
Phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-I-picrylhydrazy]) là một kỹ thuật được sử dụng
dé đo lường hoạt tính chống oxy hóa của các chất hóa học hoặc các mẫu từ tự nhiên.
Được giới thiệu đầu tiên bởi Blois vào năm 1958, phương pháp này là một trong những phương pháp phé biến để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất hoá học va thực phẩm. Cùng với đó là axit ascorbic được dùng làm đối chứng dương phô biến nhất nhờ khả năng chống oxy hóa mạnh, ôn định.
4.5.1. Kết quả đường chuẩn axit ascorbic
Mẫu axit ascorbic được pha theo dãy nồng độ từ 5 — 25 tg/mL từ dung dịch ban đầu, được thêm vào DPPH 0,5 mM đẻ thử nghiệm khả năng chống oxy hóa. Khi nồng độ axit ascorbic cảng cao mau tim của DPPH càng nhạt dần (Hình 4.10).
Sau 30 phút ủ tối, màu tím của DPPH nhạt dan từ (a) nồng độ 5 g/mL đến (e) nồng độ 25 ug/mL chứng tỏ kha năng bắt gốc tự do của mẫu axit ascorbic trong điều kiện thí nghiệm hoạt động rất tốt. Tiến hành đo OD ở bước sóng 517 nm và xử lí thống kê, được đường chuẩn như (Hình 4.1 1).
Axit ascorbic là một chất chống oxy hóa mạnh và có độ tinh khiết cao nên kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do rất tốt với chỉ số R?=0,9593 và phương trình hồi quy tuyến tính y = 1,8491x + 8,3566. Thay y = 50, được giá trị của ICso. Giá trị ICso là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
24
4.5.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá tre
Mau tinh dau lá tre được pha theo day nồng độ từ 5 — 25 wg/mL từ dung dich ban đầu, được thêm vào DPPH 0,5 mM đề thử nghiệm khả năng chống oxy hóa. Khi nồng độ tinh đầu lá tre cảng cao mau tím của DPPH càng nhạt dần (Hình 4.12).
x R . A
Đường chuân axit ascorbic
70 y = 1,8491x + 8,3566
R? = 0,9593 60 °
80 $A rae
= aer 6
ee ="
630 ——— nn rc
20 $...—
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Nong độ (ug/mL)
Hình 4.11. Đồ thị đường chuẩn axit ascorbic.
Sau 30 phút ủ tối, màu tím của DPPH nhạt dan từ (a) nồng độ 5 pg/mL đến (e) nồng độ 25 ug/mL chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do của mẫu dung dịch tinh dau trong điều kiện thí nghiệm hoạt động rất tốt. Tiến hành đo OD ở bước sóng 517 nm và xử lí thống kê, được đồ thị như (Hình 4.13).
25
Khả năng bắt gốc tự do của tỉnh dầu lá tre
50 y = 1,9546x + 0,6097 °
FT. © 20 a on
° II,
0
0 5 10 15 20 25 30
Nồng độ (wL)
Hình 4.13. Đồ thị thể hiện khả năng bắt gốc tự do của tinh dau.
Qua phương pháp thử nghiệm DPPH, tinh dau lá tre có khả năng chống oxy hóa khá tốt với chỉ số R?=0,9935 và phương trình hồi quy tuyến tính y=1,9546x + 0,6097.
Thay y = 50, được giá tri của ICso. Gia trị [Cso là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
4.5.3. Kết quả xỏc định ICsằ của cỏc mẫu bằng DPPH
Giá trị IC50 định nồng độ ức chế 50% gốc tự do. Nghiên cứu hoạt tính chống oxy
hóa sử dụng phương pháp thử nghiệm DPPH.
Bang 4.5. Kết quả xác định ICs các mẫu bằng DPPH
Mau ICso (ug/mL) Axit ascorbic 22,52 + 0,41
Tinh dau lá tre 25,15 +0,4
Giá trị ICso duge thé hiện dưới dang trung bình của 3 lan lặp lại + SE tinh bằng phương
pháp t-Test của phan mém Minitab 16.
DPPH là hop chất có màu tim được phát hiện ở bước sóng 517 nm, khi các electron của các gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa sẽ hình thành nên DPPH-H, lúc nay màu tim sẽ nhạt dan và sẽ chuyên từ màu tím sang màu vàng. Sự biến đổi màu này tương ứng với số lượng electron kết hợp với DPPH. Kết quả cho thấy giá trị ICso càng thấp tương ứng với HTCO càng cao và ngược lại, axit ascorbic 14 một chất chống oxy hóa mạnh nên được sử dụng làm đối chứng dương, giá trị ICso đạt 22,52 + 0,41 pg/mL. Qua bảng kết quả trên có thé thấy hoạt tính chống oxy hóa của tinh dau lá tre cho kết quả ICso là 25,15 + 0,4 ug/mL vậy nên hoạt tính chống oxy hóa của tinh dau
26
lá tre gần bằng của axit ascorbic điều này phan lớn đến từ hàm lượng terpenoid có trong tinh dầu và kết qua cao hơn so với nghiên cứu của (Choi va ctv, 2008) là 42,55 uL/mL và cao hơn rất nhiều so với thử nghiệm của (He Yue Jun và ctv, 2009) thực hiện trên giống Bambusa multiplex (ICso= 3,442 mg/mL") và Bambusa vulgaris (ICso= 2,705 mg/mL’) về thử nghiệm hoạt tinh chống oxy hóa của tinh dầu lá tre bang phương pháp
thử nghiệm DPPH.
21