3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ ủ đến chất lượng trà lá vối
(Cleistocalyx operculafus)” được thực hiện tại Phòng nghiên cứu Dược liệu va Cây
được liệu (Bio 309), khoa Khoa học Sinh học, Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2023 đến tháng 7/2023.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Lá vối được thu hái vào tháng 3 năm 2023 ở cây 7 năm tuôi tại huyện Lộc Ninh,
tỉnh Bình Phước.
3.2.2. Thu hoạch và xử lý mẫu lá vối
Mẫu lá sau khi thu hái được loại bỏ lá sâu, vàng úa rồi đem rửa sạch, phơi ráo đến khi độ âm trong lá còn 80 %. Tiến hành ủ mẫu ở 60°C trong 2 giờ sau đó đem mẫu trải lên bàn đến khi khô (độ âm mẫu dưới 13 %), xay thành bột và lọc qua rây có đường kính 1 mm. Cuối cùng thu mẫu bột, bảo quản trong túi kin dé tiến hành các thí
nghiệm sau.
10
3.2.3. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu Thiết bị
Cân điện tử, Máy đo quang phổ UV — 2510TS (Mỹ), Tủ sấy (Nhật Bản), Bề ồn nhiệt, Bếp điện (Hàn Quốc), Máy xay mini (Nhật Bản).
Hóa chất
AICH: (7784-13-6, Duchefa), CH3COOK (127-08-2, Merck), DMSO (67-68-5, HQ)), DPPH (Anh), FeCl; (7705-08-0, Duchefa), Folin — ciocalteu (109001, Merck), Gallic acid (149-91-7, Merck), HCl (76-47-01-0, Duksan), H;SO¿ (TQ), NaNO2 15%
(7632-00-0, Duchefa), lod (7553-56-2, Duchefa), Methanol (67-56-1, Xilong), NaOH (1310-73-2, Duchefa), Quercetin (117-39-5, Merck), NazCO3 7,5% (497-19-8, Duchefa).
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Đánh giá thành phần hoạt chất trong lá vối 3.3.1.1. Xác định độ âm mẫu
Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp cân khối lượng dựa trên sự chênh lệch khối lượng giữa mẫu nguyên liệu ban đầu và mẫu nguyên liệu sau khi say đến khối lượng không đồi.
Cân chính xác 2 g mẫu nguyên liệu vào chén sứ đã say khô và biết trước khối lượng. Cho chén chứa mẫu nguyên liệu (đã mở nắp) vào tủ sấy ở 105°C trong 3 giờ. Để nguội chén trong bình hút ầm ở nhiệt độ phòng. Đậy nắp và cân. Tiếp tục lặp lại các thao tác đến khi khối lượng giữa hai lần cân không đổi (Dược điển Việt Nam Vtập 2,
2017).
Độ âm được tính bằng công thức:
?Tn1 — m2
x 100 H(%)=
Trong đó:
H là độ ẩm mẫu (%).
m là khối lượng của mẫu (g).
m1 là khối lượng của cốc cùng với mẫu thử và nắp trước khi say (9).
m2 là khối lượng của cốc cùng với mẫu thử và nắp sau khi sấy (g).
3.3.1.2. Định tính các hợp chất trong lá lá vối
Phương pháp định tính các hợp chất có trong cây được tiễn hành theo phương
pháp cô lập hợp chất hữu cơ (Trần Hùng và ctv, 2004; Nguyễn Phi Kim Phụng và ctv,
2007).
Chuan bị mẫu dịch chiết: Cân 1 g mẫu cho vào bình thủy tinh, sau đó thêm vào 15 mL dung môi. Ngâm trong 24 giờ, lọc dịch chiết bằng giấy loc Whatman Nol.
Định tính Polyphenol
Lay 2 mL dich chiét sau d6 thém vao 3 giọt FeCl; 5 % lac déu, dung dịch có màu xanh đen chứng tỏ có sự hiện diện của Polyphenol trong dịch chiết.
Định tính Flavonoid
Chuan bị 1 mL dịch chiết, sau đó thêm lần lượt 0,3 mL NaNO2 15%, lắc nhẹ dé yên 5 phút. Sau đó thêm 0,3 mL AICI; 10%, lắc nhẹ dé yên 5 phút. Cuối cùng thêm 4 mL NaOH 4%, lắc nhẹ dé yên 1 phút. Quan sát kết quả, nếu mẫu dịch chiết có chứa Flavonoid thì ống nghiệm cho màu từ vàng đến cam, hoặc cam đỏ đến tím.
Định tính Tanin
Lay 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm sau đó nhỏ 3 — 5 giọt Gelatin - NaCl vào ông nghiệm, xuất hiện tủa bông trang cho thấy có sự hiện diện của Tanin.
Định tính Saponin
Lay 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vào 5 mL nước cất, đậy nắp rồi lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu bọt bền sau 15 phút chứng tỏ mẫu dịch chiết
có chứa Saponin.
Định tính Terpenoid
Lay 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vào ống nghiệm 2 mL Chloroform va 3 giọt H2SO.aa, kết quả tạo thành 1 lớp mỏng trên bề mặt màu nâu đỏ là
dương tính.
Định tính Alkaloid
Cô cắn 5 mL dịch chiết trong bé ổn nhiệt sau đó hòa cắn trong 4 mL HCI 5%, rồi nhỏ 3 giọt thuốc thử Wagner vao. Kết tủa nâu đỏ đượcc tao thành cho thấy sự hiện diện của Alkaloid trong dịch chiết.
3.3.1.3. Xác định hàm lượng Polyphenol và Flavonoid bằng phương pháp quang phố
Chuẩn bị mẫu dịch chiết
Cân 1g mau lá vối cho vào bình thủy tinh sau đó thêm vào 15 mL dung môi, ngâm ở các mức thời gian 1 giờ, 5 gid, 24 giờ. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc
12
Whatman Nol. Thí nghiệm được thực hiện riêng rẽ với hai loại dung môi ethanol 96%
va nước nóng.
Phương pháp quang phố
Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh áng của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. Phương trình định lượng của
phép đo dựa trên định luật Lamber - Beer: A = K.C Trong đó:
A: Độ hấp thụ quang
K: Hang số thực nghiệm C: Nông độ chat phân tích
Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất khoảng 10° — 10M va là một trong những phương pháp được sử dụng khá phô biến trong phân tích.
Xác định hàm lượng Polyphenol bằng phương pháp quang phố
Nguyên lý: Hàm lượng Polyphenol được xác định bằng phương pháp Folin - Ciocalteu. Trong thành phần thuốc thử Folin - Ciocalteu có phức hợp phosphowolfarm-phosphomoybdat. Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất Polyphenol tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, hap thu cực đại ở bước sóng 765 nm. Hàm lượng Polyphenol có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ mẫu và
được tính theo Gallic acid (Yadav và ctv, 2011).
Quy trình xác định hàm lượng dựa theo McDonald và ctv (2001). Chất chuẩn Gallic acid được chuẩn bi ở các nồng độ 50, 100, 150, 200, 250 (ug/mL) trong methanol. Hút 0,5 mL Gallic acid cho vào ống nghiệm sau đó thêm 5 mL Folin — Ciocalteu 10 % và 4 mL NazCOa 1M. Lắc đều, ủ mẫu trong tối ở nhiệt độ phòng trong
15 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 765 nm.
Thí nghiệm trên mẫu dịch chiết: Hút 0,5 mL mẫu cần định lượng cho vào ống nghiệm sau đó thêm 5 mL Folin — Ciocalteu 10 % và 4 mL Na2CO3 1M. Lắc đều, ủ mẫu trong tối ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 765
nm.
Hàm lượng Polyphenol toàn phần chứa trong mẫu dịch chiết được đo lường bằng hàm lượng Gallic acid đương lượng (GAE) và được tính bằng công thức:
_CXVXF
TPC = 7x 1000
Trong đó:
C: Néng độ Gallic acid ngoại suy từ đường chuẩn (ug/mL).
V: Thể tích mẫu phân tích (mL).
F: Độ pha loãng.
m: Khối lượng mẫu thử (g).
TPC: Hàm lượng Polyphenol tổng số của mẫu thử (mg GAE/g).
Xác định hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp quang phố
Nguyên lý: Hàm lượng Flavonoid được xác định thông qua phan ứng tạo mau với
AICI. AICl: liên kết tạo phức hợp có màu bền với nhóm ketone ở C4 và các nhóm hydroxyl ở C3 hoặc C5 trong cấu trúc của Flavone hay Flavonol. Để định lượng Flavonoid, độ hấp thụ của phức hợp mau được ghi nhận tại bước sóng 415 nm voiphan
ứng CH3COOK — AICl; (Chang va ctv, 2002).
Quy trình xác định hàm lượng theo Kumari va Shama (2015). Chất chuan Quercetin được chuẩn bị ở các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 (ug/mL) trong ethanol 80
%. Hút 1 mL Quercetin cho vào ống nghiệm sau đó thêm vào 0,1 mL AICl: 10 %, 0,1 mL CH3COOK IM và 2,8 mL nước cất. U mẫu ở nhiệt độ phòng 30 phút, sau đó dem
đi đo ở bước sóng 415 nm.
Thí nghiệm trên mẫu dịch chiết: Hút 1 mL mẫu cần định lượng cho vào ống
nghiệm sau đó thêm vào 0,1 mL AIC]: 10 %, 0,1 mL CH3COOK 1M và 2,8 mL nước
cất. U mau ở nhiệt độ phòng 30 phút, sau đó đem đi đo ở bước sóng 415 nm.
Hàm lượng Flavonoid toàn phần chứa trong mẫu dịch chiết được đo lường bằng hàm lượng Quercetin đương lượng (QE) và được tính bằng công thức:
Trong đó:
C: Nồng độ Quercertin ngoại suy từ đường chuẩn (ug/mL).
V: Thể tích mẫu phân tích (mL).
F: Độ pha loãng.
m: Khối lượng mau thử (g).
TFC: Hàm lượng Flavonoid tổng số của mẫu thử (mg QE/g).
14
3.3.2.Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ tới hàm lượng hợp chất Polyphenol và Flavonoid trong lá vối
Bồ trí thí nghiệm với 2 nhân tổ là nhiệt độ và thời gian ủ mẫu.
Nhiệt độ: 50°C, 60°C, 70°C.
Thoi gian: 1 gid, 2 gid, 3 gid.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo đõi: hàm lượng hợp chất Polyphenol và Flavonoid bằng phương pháp quang phô.
3.3.3. Khao sát hoạt tính chống oxy hóa, kiểm nghiệm vi sinh và đánh giá cảm quan trà túi lọc lá voi
3.3.3.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trong lá vối bằng phương phápDPPH Nguyên tắc: Hoạt tính chống oxy hóa được khảo sát thông qua phản ứng giữa các chất chống oxy hóa với DPPH gốc bền (Blois, 1958). Dựa trên cơ sở phản ứng trung hòa gốc tự do và làm giảm màu giữa các chất có tác dụng chống oxy hóa với thuốc thử 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Các gốc DPPH tự do có độ hap thu cực đại ở
bước sóng 517 nm và có màu tím.
Thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxy hóa được thực hiện dựa theo phương pháp của Bhuiyan va ctv (2009) có hiệu chỉnh. Mẫu lá véi được ngâm chiết trong dung môi nước nóng với tỉ lệ 1:15 (1 g mẫu trong 15 mL nước nóng) trong 24 giờ. Sau đlọc dịch chiết, dem đi cô cách thủy và sấy ở 50°C để loại bỏ nước thu lấy cao. Mẫu cao được pha loãng với DMSO 50 % thành các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 ug/mL.
Hút 1 mL mẫu thử nghiệm ở các nồng độ vào ống nghiệm có nắp đậy, cho vào mỗi ống 3 mL dung dịch DPPH 0,004% được pha trong methanol. Đậy nắp kín và lắc đều các ống nghiệm. Dé yên các ống nghiệm trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Sau 30 phút, do mẫu ở bước sóng 517 nm. Acid ascorbic được sử dụng làm đối chứng dương, được pha trong nước cất thành các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 ug/mL. Mẫu đối chứng âm của lá vối chứa 1 mL DMSO 50% và 3 mL DPPH 0,004%. Mẫu đối chứng âm của Acid ascorbic chứa 1 mL nước cất và 3 mL DPPH 0,004%.
Hoạt tính chống oxy hóa được tính bằng công thức:
Ac — As Ac
x 100
Hoat tinh chéng oxy hóa (%) =
Trong đó:
Ac tương ứng với độ hấp thụ của mẫu đối chứng âm.
As tương ứng với độ hấp thụ của mẫu thử nghiệm.
Từ tỷ lệ phan trăm hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ khác nhau của mẫu thử nghiệm, xây dựng phương trình tương quan tuyến tính y = ax + b với y là phần trăm hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ mẫu thử nghiệm. Dựa vào phương trình, xác định được giá trị IC50, là giá trị biểu thị nồng độ cần thiết để khử 50% gốc tự do DPPH. Giá trị ICso càng thấp thì hoạt tính chống oxy hóa càng cao.
3.3.3.2. Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật
Mau trà được gửi đi kiêm định vi sinh tai Phong Vi Sinh Ung Dụng, Viện nghiên
cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, với 5 chỉ tiêu vi sinh vậtsau:
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884: 2005.
Xác định Coliforms theo TCVN 6848: 2007.
Xác định nắm men, nam mốc theo TCVN 8275 -1:2010.
Xác định Salmonella theo TCVN 4829:2005.
3.3.3.3 Làm trà túi lọc lá vối
Mẫu lá vôi sau khi xác định thời gian và nhiệt độ tối ưu nhất được đem đi ủ, sau đó cắt nhỏ từ 2 — 3 cm, dé khô ở nhiệt độ phòng. Lá sau khi khô (độ âm dưới 10 % theo TCVN 7975:2008) được sao trên bếp điện ở nhiệt độ 60 — 70°C trong 3 — 4 phút.
Tiếp theo sấy ở 80°C trong 5 phút rồi đem xay. Cuối cùng, cân chính xác 1 g mẫu bột lá vối cho vào túi lọc, ép kín miệng túi, bảo quản các túi lọc trong túi zip có hút chân
không.
Quá trình làm trà được thực hiện với điều kiện phòng đã lau dọn sạch, kín, hạn chế ra vào. Các dụng cụ được say ở 90°C trong 15 phút trước khi sử dụng.
Đánh giá cảm quan
Tiến hành pha mẫu với 100 mL nước nóng, ngâm mẫu với các khoảng thời gian khác nhau: 5 phút, 10 phút và 20 phút. Mẫu được đánh giá cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 3218 — 2012 dé chọn ra thời gian pha phù hợp cho trà. Thí nghiệm đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm được thực hiện dựa theo các chỉ tiêu được quy định trong TCVN 3218 — 2012. Cách tính điểm phải đúng theo quy định đối với từng
chỉ tiêu.
16
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel và phần mềm Minitab 16. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng Turkey’s test.