4.1. Đánh giá thành phần hoạt chất trong lá vối 4.1.1. Độ am bột
Độ âm là hàm lượng nước chứa trong sản phẩm, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng va quá trình bảo quản mẫu. Độ 4m dược liệu càng thấp thì toi gian bảo quan càng lâu, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật va nắm men, nắm mốc đến dược liệu.
Độ am bột lá vi là 8,5 % phù hợp với yêu cầu về độ âm của dược liệu, không
vượt quá 13 %.
4.1.2. Định tính các hoạt chất trong lá vối
Bảng 4.1. Kết quả định tính một số hợp chất trong lá vối
Nhóm chât Phương pháp H20 Ethanol 96 % Polyphenol FeCl3 5 % + +
Flavonoid NaNO; 15 % + AIC]; 10 % + + + NaOH 4%
Tannin Gelatin + NaCl + + Saponin Bot bén “ly ° Terpenoid Chloroform + H2SO4 sa + + Alkaloid Wagner + + Phan ứng dương tính (+); Phan ứng âm tính (-).
Kết quả ở bảng 4.1 cho thay mau lá vối được chiết ở hai loại dung môi đều có sự hiện diện của các hợp chất Polyphenol, Flavonoid, Tanin, Terpenoid, Alkaloid. Hợp chat Saponin chỉ xuất hiện ở dich chiết nước. Sự khác biệt này có thé do dung môi chiết xuất khác nhau làm ảnh hưởng đến việc chiết xuất các hợp chất trong cây.
Dựa vào kết quả định tính cho thấy sự hiện diện của Polyphenol và Flavonoid trong mau lá vôi, đây sẽ là cơ sở đề tiến hành các thí nghiệm định lượng tiếp theo.
18
Kết quả các thí nghiệm định tính được thé hiện từ hình 4.2 - 4.5:
Hình 4.1. Mẫu đối chứng dịch chiết lá vối ở hai dung môi nước nóng và
ethanol. (a) Dịch chiết nước nóng; (b) Dịch chiétt ethanol 96 %.
a b
4.2. Dinh tinh Polyphenol. (a) 4.3. Dinh tinh Flavonoid. (a) Dich Dich chiết nước nóng; (b) Dich chiết nước nóng; (b) Dich chiết chiétt ethanol 96 9. ethanol 96 %.
Hình 4.4. Dinh tính Saponin. (a) Hinh 4.5. Dinh tinh Tannin. (a) Dịch chiết nước nóng; (b) Dich chiétt Dịch chiết nước nóng; (b) Dich ethanol 96 %. chiétt ethanol 96 %.
ơmỊ 1 ơsryrap= Tet ‹
Hình 4.6. Định tinh Alkaloid. (a) Hình 4.7. Định tính Terpenoid. (a)
Dịch chiết nước nóng; (b) Dịch chiétt Dịch chiết nước nóng; (b) Dịch chiên ethanol 96 %. ethanol 96 %.
4.1.3. Khao sát anh hướng của dung môi va thời gian chiết đến hàm lượng Polyphenol và Flavonoid trong lá vối
Thí nghiệm được thực hiện với hai loại dung môi nước nóng(95 — 100°C) và ethanol 96 %. Tỉ lệ mẫu và dung môi là 1:15 (1 g mẫu với 15 mL dung môi) ở thời gian chiết 1 giờ, 5 giờ, 24 giờ.
Xác định hàm lượng Polyphenol
Hàm lượng Polyphenol trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩn Gallic acid với nồng độ từ 50 — 250 pg/mL. Dựa vào tương quan giữa nồng độ Gallic acid và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 765 nm, tiến hành xây dựng đường chuan Gallic acid dé xác định hàm lượng Polyphenol có trong lá vôi.
Đường chuẩn Gallic acid
16
1.4 te
y = 0.0058x + 0.0177 sae
gt R?=0.9996 ..Ÿ
08 <a
= 06 ệ,,"
3 04 =
Ấ o2 †
0
0 50 100 150 200 250 300
Nồng độ Gallic acid (g/mL)
Hình 4.8. Đường chuẩn Gallic acid.
20
Dựa vào đường chuẩn Gallic acid dé xác định hàm lượng Polyphenol theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0058x + 0,0177 với R? = 0,9996.
Bảng 4.2. Kết quả hàm lượng Polyphenol ở hai loại dung môi và các mức thời gian chiết Dung môi Thời gian chiết
1 giờ 5 giờ 24 giờ Nước nóng 38,70 + 0,26 46,18 + 0,34 50,69? + 0,61 Ethanol 96 % 30,86! + 0,36 35,76° + 0,46 41,29° + 0,57
Don vi: mg/g.
Trong cùng một hàng, các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mặt thông kê (P<0,05).
Quan sát kết quả ở bảng 4.2 cho thấy thời gian và dung môi chiết ảnh hưởng lớn đến hàm lượng hợp chất Polyphenol, cụ thể khi thời gian chiết tăng lên làm cho hàm lượng hợp chất tăng theo, thời gian chiết lâu giúp thu nhận được tối đa hàm lượng hợp chất hơn. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng hợp chất Polyphenol đã được nghiên cứu trước đây (Huỳnh Kim Yến và ctv,
2022).
Bên cạnh đó có thé thấy được mẫu lá véi khi chiết ở dung môi nước nóng cho hàm lượng Polyphenol cao hơn so với dịch chiết ethanol 96 % với hàm lượng lần lượtlà 50,69 + 0,61 mg/g và 41,29 + 0,57 mg/g. Điều này có thê giải thích rằng nhiệt độ cao có thể làm mềm mô thực vật, tăng tốc độ thâu thấu, khuyếch tán của dung môi vào nguyên liệu giúp cho quá trình chiết tách diễn ra nhanh hơn (Dutra và ctv, 2008).
Xác định hàm lượng Flavonoid
Hàm lượng Flavonoid trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩn Quercetin với nồng độ từ 20 - 100 pg/mL. Dựa vào tương quan giữa nồng độ Quercetin và giá trị mật độ quang đo được tai bước sóng 415 nm, tiễn hành xây dựng đường chuẩn Quercetin dé xác định hàm lượng Flavonoid có trong lá véi.
Dựa vào đường chuẩn Quercetin để xác định hàm lượng Flavonoid theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0066x + 0,003 với R? = 0,9996.
Duong chuan Quercetin
0.7
Bệ~
0.6 : y =0.0066x+0.003 ằ
Mu R?=0.9996 ..'
ơ 04 „ 0.3
0.2 0.1
1m)
Abs (415
0 50 100 150 Nông độ Quercetin (j1g/mL)
Hình 4.9. Đường chuan Quercetin
Bảng 4.3. Kết quả hàm lượng Flavonoid ở hai loại dung môi và các mức thời gian chiết
Thời gian chiét Dung môi
1 giờ 5 giờ 24 giờ Nước 15,33°+ 0,21 17,204 + 0,22 22,06° + 0,13 Ethanol 96 % 16,33° + 0,22 20,41° + 0,27 27,18^+ 0,19
Don vị: mg/g.
Trong cùng một hàng, các giá trị trung bình co kí tự theo sau Khác nhau có sự khác biệt về
mặt thông kê (P<0,05).
Dựa vào kết quả ở bảng 4.3 cho thấy được thời gian chiết càng lâu lượng hợp chất Flavonoid càng tăng va ở dịch chiết ethanol cho hàm lượng hợp chat Flavonoid cao hơn so với dịch chiết nước nóng với hàm lượng lần lượt là 27,18 + 0,19 mg/g va 22,06 + 0,13 mg/g. Điều đó cho thấy dung môi ethanol có khả năng hòa tan các hợp Flavonoid tốt hơn so với nước nóng. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu về khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng hợp chất Flavonoid trước đây (Nguyễn Văn Thom, 2018; Niawanti và ctv, 2019).
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ tới hàm lượng hợp chất Polyphenol và Flavonoid trong lá vối
Sau khi khảo sát được dung môi và thời gian chiết tối ưu nhất ở nội dung 1 tiễn hành cân 1g mẫu lá vối cho vào bình thủy tinh sau đó thêm vào 15 mL nước nóng(95 —
100°C). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc Whatman Nol sau 24 giờ.
Thí nghiệm khảo sat ảnh hưởng của nhiệt độ ở 50°C, 60°C, 70°C va thời gian ủ
mẫu là 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ đến hàm lượng hợp chất Polyphenol và Flavonoid.
22
Xác định hàm lượng Polyphenol
Hàm lượng Polyphenol trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩn Gallic acid với nồng độ từ 50 — 250 pg/mL. Dựa vào tương quan giữa nồngđộ Gallic acid và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 765 nm, tiến hành xây dựng đường chuan Gallic acid dé xác định hàm lượng Polyphenol có trong lá voi.
Đường chuẩn Gallic acid
1.6
1.4 „®
= y = 0.0055x + 0.0114 ”
oe F R? =0.9997 or
= os = ae
`©
& 06 Š,"
S 04 :ẫ =
0.2 T
0
0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ Gallic acid (ng/mL)
Hình 4.10. Đường chuẩn Gallic acid
Dựa vào đường chuan Gallic acid dé xác định hàm lượng Polyphenol theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0055x + 0,0114 với R? = 0,9997.
Bảng 4.4. Kết quả hàm lượng Polyphenol ở các mức nhiệt độ và thời gian ủ
Nhiệt độ Thời gian
1 giờ 2 giờ 3 giờ 50°C 36,42! + 0,27 41,833 + 0,25 38,67° + 0,40 60°C 43,70° + 0,30 51,3174 0,38 41,994 + 0,25 70°C 45,76” + 0,42 44,13° + 0,23 39,42° + 0,27
Don vi: mg/g.
Trong cung một hàng, các giá tri trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mặt thông kê (P<0,05).
Dựa vào kết quả ở bảng 4.4 cho thấy nhiệt độ và thời gian ủ ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng Polyphenol. Điều đó cho thấy khi ở nhiệt độ càng cao hàm lượng hợp chất càng tăng, nhưng nhiệt độ cao quá sẽ làm hợp chất bị phân hủy hoặc biến tính dẫn đến hàm lượng hợp chất bị suy giảm (Madrau và ctv, 2009). Kết quả nghiên cứu này cũng tương đồng với khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ say đến hàm lượng các hợp chat khác trước đây (Nguyễn Thy Đan và ctv, 2022; Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2018).
Bên cạnh đó qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm cho thay màu sắc và mùi vi ở
các mức thời gian và nhiệt độ ủ cũng không giống nhau. Các mẫu lá vối ủ ở 50°C vẫn còn màu xanh của lá và có vị nồng hơn so với các mẫu ủ khác. Mẫu ở 60°C cho mùi thơm dễ chịu, màu sắc hài hòa hơn so với mẫu ủ ở 70°C (ít thơm và có màu đậm hơn).
Do đó chọn mức thời gian ủ là 2 giờ ở nhiệt độ 60°C với mức hàm lượng Polyphenol
thu được cao nhất là 51,31 + 0,38 mg/g.
Xác định ham lượng Flavonoid
Hàm lượng Flavonoid trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩn Quercetin với nồng độ từ 20 - 100 ug/mL. Dựa vào tương quan giữa nồng độQuercetin và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 415 nm, tiến hành xây dựng đường
chuan Quercetin đê xác định hàm lượng Flavonoid có trong lá vôi.
Đường chuân Quercetin
0.7
2 0.6 =
y = 0.0065x - 0.0074
zig, OP R? = 0.9997
BH 04 F ae
wm oe
= O03
* © Be 02 :
< o1 a
0
0 20 40 60 80 100 120
Nong độ Quercetin (g/ml)
Hình 4.11. Đường chuẩn Quercetin
Dựa vào đường chuẩn Quercetin để xác định hàm lượng Flavonoid theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0065x — 0,0074 với R? = 0,9997.
Bang 4.5. Kết qua hàm lượng Flavonoid ở các mức thời gian và nhiệt độ ủ
; Thoi gian
Nhiệt độ 1 giờ 2 giờ 3 giờ
50°C 15,52f+ 0,18 15,81°+ 0,28 15,171+ 0,15 60°C 17,25 + 0,18 24.21^+ 0,18 18,23 + 0,29 70°C 16,75% + 0,25 19,04 + 0,25 17,98 + 0,32
Don vi: mg/g ; Trong cung một hang, các giá trị trung bình co ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thông kê (P<0,05).
Dựa vào bảng 4.5 cho thấy hàm lượng Flavonoid của mẫu lá vối được ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 50°C - 70°C đều có xu hướng tăng theo thời gian u từ 1 giờ
24
đến 2 giờ nhưng giảm ở 3 giờ. Điều đó cho thấy thời gian ủ ảnh hưởng lớn đến hàm lượng hợp chat Flavonoid trong lá vối, thời gian ủ lâu không làm cho hàm lượng hợp chất tăng lên mà bị giảm đi.
Bên cạnh đó nhiệt độ ủ cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng hợp chất, cụ thể hàm lượng Flavonoid giảm khi nhiệt độ ủ thấp (50°C), tăng khi nhiệt độ cao (60°C), nhưng ở nhiệt độ cao hơn lại giảm xuống (70°C). Hàm lượng Flavonoid trong mẫu thu được cao nhất khi ủ ở nhiệt độ 60°C với thời gian ủ là 2 giờ cho hàm lượng là 24,22 + 0,18 mg/g. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm
lượng Flavonoid trong vỏ cam trước đó (Chen và ctv,2011).
4.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, kiểm nghiệm vi sinh và đánh giá cảm quan trà
túi lọc lá vôi
4.3.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của lá voi bằng phương pháp DPPH
Từ kết quả do mật độ quang tại bước sóng 517 nm và tính toán kết quả hoạt tính chống oxy hóa của Ascorbic acid, mẫu cao lá vối, xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ chất khảo sát có dạng y = ax + b. Trong đó, y là hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ chất khảo sỏt. Thay giỏ trị y = 50, vào phương trỡnh hồi quy xỏc định được giỏ tri ICằ tương ứng.
Kết quả hoạt tính chống oxy hóa của Ascorbic acid và mẫu lá với được thể hiện ở bang
dưới đây:
Bang 4.6. Kết quả khảo sat ICso theo phương pháp DPPH
Chât khảo sát Phương trình hôi quy ICso (ug/mL)
Ascorbic acid y=3,7499x + 4,765 với R? = 0,9878 12,03 + 0,39 Lá vối y = 1,5022x + 10,461 với R? = 0,9931 26,27 + 0,63
Kết quả được thé hiện dưới dạng giá trị trung bình (+ SEM).
Hoạt tính chống oxy hóa của lá vôi xác định được là 26,27 + 0,63 ug/mL, của đối chứng Ascorbic acid là 12,03 + 0,39 pg/mL, như vậy hoạt tính chống oxy hóa của lá vôi thấp hon Ascorbic acid 2,18 lần. Vì Ascrobic acid được biết đến là một chất chống oxy hóa mạnh, và là đối chứng chuẩn được sử dụng trong thí nghiệm nên có độ tinh khiết cao trong khi mẫu lá vôi chỉ là một dịch chiết thô không qua tinh chế. Mặt khác khi so sánh hoạt tính chống oxy hóa của mẫu lá vối với mẫu lá diếp cá có ICso = 62,237 ug/mL, (Phạm Ngọc Khôi và Phùng Thanh Sơn, 2023), mẫu lá 6i ICso= 24,01 ug/mL (Nguyễn Thị Bích Thuyền, 2023), mẫu cây sâm xuyên đá có ICso = 90,14 + 9,64 ug/mL (Damaso và ctv, 2020) cho thay mẫu lá véi có hoạt tính chống oxy hóa
mạnh.
4.3.2. Kiểm nghiệm vi sinh
Vi sinh vật là những sinh vật có kích thước rất nhỏ, không thể quan sát bằng mắt thường được mà phải sử dụng kính hiển vi. Nhiễm vi sinh vật trong quá trình làm trà có thé gây ảnh hưởng đến chất lượng, ngộ độc cho người tiêu dùng Dé đảm bảo chất lượng của trà cũng như sức khỏe cho người tiêu dùng, tiến hành gửi mẫu kiểm định vi
sinh vật.
Mẫu trà túi lọc lá vối được gửi đi kiểm định vi sinh ở Phòng Vi Sinh Ứng Dụng,
Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường.
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra vi sinh vật trong sản phẩm trà túi lọc lá vối
STT Chi tiéu Két qua Phương pháp thử Giới hạn cho phép 1 Tông vi khuân 1,1 10 TCVN 4884:2005 1x 10°
hiệu khí (CFU/g)
2 Tổngsốnấmmen Không phát hiện TCVN 8275 - 1 x 104 (CFU/g) 1:2010
3 Téngsdnamméc Không phát hiện TCVN 8275 - 1x10!
(CFU/g) 1:2010
4 Coliforms Không phat hién TCVN 6848:2007 1x 10°
(CFU/g)
3 Salmonella spp. Không phat higén TCVN 4829:2005 Không được (CFU/25g) phép có
Dựa vào kết quả bảng 4.8 so với TCVN 7975:2008 về trà thảo mộc túi lọc thì sản phẩm trà túi lọc lá vôi đạt yêu cầu về vi sinh trong thực pham.
4.3.3. Đánh giá cảm quan để chọn ra thời gian pha trà phù hợp
Từ kết quả khảo sát thời gian và nhiệt độ sơ chế lá vôi, chọn ra được mức thời gian tối ưu nhất là 2 giờ và nhiệt độ là 60°C dé ủ lá sau đó tiến hành các bước làm trà túi lọc. Cuối cùng pha trà ở các mức thời gian dé lựa chọn ra thời gian pha trà phù hợp.
Bảng 4.8. Kết quả đánh giá cảm quan trà qua các mức thời gian
Thời gian pha trà Điểm chat lượng
5 phút 14,55 10 phút 16,87 20 phút 16,06
26
Sau khi khảo sát cảm quan trà trên 30 người, ở thời gian 10 phút cho điểm đánh giá cảm quan cao nhất với 16,87 điểm, trà thuộc loại khá. Theo cảm nhận của người thử trà thì ở 3 mức thời gian pha trà đều có màu nâu đỏ, nhưng ở 10 phút trà cho mùi thơm hơn và có vị hơi dang nhẹ, không quá nhạt như pha ở 5 phút và cũng không quá gắt khi pha ở 20 phút, vì vậy lựa chọn thời gian pha trà là 10 phút phù hợp với phần
đông người sử dụng.
4.3.4. Xác định hàm lượng Polyphenol và Flavonoid qua các mức thời gian pha trà
Hàm lượng Polyphenol trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuin Gallic acid với nồng độ từ 50 — 250 ug/mL. Dựa vào tương quan giữa nồng độ Gallic acid và giá trị mật độ quang đo được tại bước sóng 765 nm, tiến hành xây dựng đường chuẩn Gallic acid để xác định hàm lượng Polyphenol có trong trà lá vối.
Đường chuẩn Gallic acid
14
-®
1.2 y =0.0051x + 0.0544
8 1 R? = 0.9977
wn 08 oe XB 2
© 06 oo
3 s4 04 =
0.2 0
0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ Gallic acid (g/mL)
Hình 4.13. Đường chuẩn Gallic acid
Dựa vào đường chuẩn Gallic acid dé xác định hàm lượng Polyphenol theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0051x + 0,0544 với R? = 0,9977.
Hàm lượng Flavonoid trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩn Quercetin với nồng độ từ 20 — 100 g/mL. Dựa vào tương quan giữa nồng độ Quercetin và giá trị mật độ quang do được tại bước sóng 415 nm, tiễn hành xây dựng đường chuẩn Quercetin đề xác định hàm lượng Flavonoid có trong trà lá vối
Đường chuân Quercetin
0.6
@ °° y=0.0054x - 0.0062 .®
S 04 2=
ki R?=0:9997——T—-
= 03 ae
5 0.2 " s
Ấ 01 e
0
0 20 40 60 80 100 120
Nong độ Quercetin (ig/ml)
Hình 4.14. Đường chuẩn Quercetin
Dựa vào đường chuẩn Quercetin để xác định hàm lượng Flavonoid theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0054x — 0,0062 với R? = 0,9997.
Bảng 4.9. Kết quả hàm lượng Polyphenol và Flavonoid qua các mức thời gian
Thời gian Hàm lượng Polyphenol Hàm lượng Flavonoid
(mg/g) (mg/g)
5 phut 18,67° + 0,31 7,92° + 0,08
10 phút 20,69 + 0,25 9,39 + 0,06
20 phút 22,12 + 0,26 10,72* + 0,18
Trong cùng một cột, các giá tri trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt
thông kê (P<0,05).
Kết quả bảng 4.10 cho thấy hàm lượng Polyphenol và Flavonoid đều tăng dần theo thời gian pha trà với hàm lượng lần lượt là 22,12 + 0,26 mg/g và 10,72 + 0,18 mg/g. Kết qua hàm lượng trà pha ở 20 phút cao hơn so với trà pha ở 5 phút và 10 phút nhưng khi so sánh kết hợp với kết quả đánh giá cảm quan trà qua các mức thời gian thì ở 10 phút cho kết quả cao hơn và được nhận xét là có mùi thơm và vi ngon hơn các thời gian pha còn lại nên sẽ chọn thời gian pha trà thích hợp nhất là 10 phút.
28