DANH SÁCH CÁC BANG
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 2/2023 đến tháng 6/2023.
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là nấm AM trong đất trồng lúa thu thập tại 7 xã thuộc 3 huyện của tĩnh Long An. Bao tử nắm AM được nhân nguồn và phân lập là đất từ vùng trồng lúa ở Long An.
Giống lúa sử dụng là Nang Hoa dé khảo sát lai sự cộng sinh của nấm AM trên lúa ở các mẫu dat đã thu được và giống IR50404 để khảo sát sự công sinh ở các độ mặn khác nhau cả 2 đều là giống được trồng khá phố biến ở Long An do. Phân bón: phân urê
(46%), MAP.
3.2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
Thiết bị: kính hiển vi, kính soi nổi, cân điện tử, máy ly tâm, lam kính, lamen, đĩa petri, Ống ly tâm 50ml, ống tiêm, ray 40 pm, ray 500 pm.
Hóa chat: KOH 10%, HCl 2%, sucrose, trypan blue 0,05%, acid lactic, glycerol,
melzer, PVLG.
3.3. Phuong pháp nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Thu mẫu và phân lập nắm AM tại các vùng đất trồng lúa ở Long
An.
3.3.1.1.Thu mẫu
Thu thập 28 mẫu đất trồng cây lúa tại các ruộng lúa ở 7 xã (Nhơn Thạnh Trung (Tân An), Lạc Tấn (Tân Trụ), T.T Tân Trụ (Tân Trụ), Tân Đức (Tan Trụ), Nhựt Linh(Tân Trụ), Tân Phước Tây (Tân Trụ), Tân Trạch (Cần Đước) thuộc 3 huyện Tân An, Tan Trụ, Cần Đước, tĩnh Long An. Mỗi xã lay 4 mẫu, mỗi ruộng thu mẫu dat tại 5 vị trí khác nhau tại các gốc lúa (vị trí thu mẫu), loại bỏ khoảng 1 cm lớp đất bề mặt, sau đó lay khoảng 200 g đất ở vị trí rễ của cây ở độ sâu 0 - 20 cm. Sau đó trộn đều các mẫu đất thu được và thu lay lượng mẫu cuối cùng là 1000 g dat/mau. Mẫu được lấy, van chuyển và bảo quản theo tiêu chuẩn Việt Nam 5960 : 1995.
14
3.3.1.2. Phương pháp tách bào tử
Bảo tử được tách khỏi đất bằng kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết hop với ly tam
trong dung dich đường sucrose (50%) theo Brundrett va ctv (1996) có chỉnh sửa.
Bước 1: loại bỏ các hạt đất đá to va rác thô sau đó cân 50 g đất, cho vào cốc chứa 500 ml nước, khuấy đều và dé khoảng 30 phút.
Bước 2: khuấy đều chờ lắng khoảng 30 giây sau đó cho dịch nổi qua các rây có kích thước lần lượt là 500 um và 40 pm. Quá trình này được lặp lại hai lần sau đó lọc với nước đến khi nước chảy qua rây không còn đục.
Bước 3: thu phan đất và dich bao tử trên ray vào ống falcon thé tích 50 ml. Sau đó bồ sung dung dich sucrose 50% theo tỷ lệ 1:1 để tạo môi trường ưu trương làm các bào tử trương đường và nôi lên. Lắc đều dé dung dịch sucrose trộn đều với dịch bào tử.
Bước 4: ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong vòng 5 phút các bao tử sẽ nồi lên.
Bước 5: cho dịch nỗi trong ống falcon qua ray 40 pm và rửa đường sucrose dưới vòi nước cho đến khi sạch đường.
Bước 6: thu lại bao tử trên ray 40 um, bao quản ở nhiệt độ 4 - 8 °C. Quan sát va
đếm số bào tử dưới kính soi nồi.
3.3.1.3. Khảo sát lại khả năng cộng sinh của nắm AM
Theo Pham Thị Hải Nghi và ctv, (2021) đã ghi nhận có sự cộng sinh của nam AM trong rễ lúa. Căn cứ vào đó thực hiện khảo sát cộng sinh của AM trên cây lúa ở 28 mẫu đất nguồn được thu thập tại Long An. Sử dung ly nhỏ 100ml dé làm thí nghiệm cho 28 mau dat mỗi mẫu 2 ly dé khảo sát ở giai đoạn 14 và 28 ngày tổng cộng 56 ly.
Giống lúa sử dụng là lúa Nang Hoa là giống lúa được trồng phổ biến ở Long An.
Hạt lúa được xử lý trước khi gieo, sau đó chọn những hạt mọc mam và gieo vào ly đã chuẩn bị sẵn, mỗi ly gieo 3 hạt lúa đã nảy mam, Thí nghiệm được bố trí trong nhà lưới, nước được tưới hằng ngày vào buôi sáng.
3.3.2. Nội dung 2: Định danh nắm AM dựa vào đặc điểm, hình thái bào tử.
3.3.2.1. Định danh bào tử dựa vào hình thái
Nhỏ một giọt dung dịch PVLG + melzer (tỷ lệ 1:1) lên lam kính, trên mỗi giọt thuốc nhuộm đặt bào tử nắm AM lên sau đó đậy lame lại. Dùng đầu kim ấn trực tiếp lên lame ở mỗi bảo tử. Quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc, số lớp của thành bào tử, và hình dạng cuống bao tử bằng kính hiển vi ở vật kính 40X và định danh dựa theo Brundrett và ctv (1996) kết hợp với các mô tả và hình ảnh của Invam.
Một số chi nam AM phổ biến thường gặp là: Acaulospora, Entrophospora,
Glomus, Gigaspora, Scutellospora.
Bào tử chi Acaulospora có hình cau, bau duc hay elip, kích thước từ 40 - 400 pm, màu sắc từ trong suốt, đến vàng nhạt, đỏ nâu hoặc nâu, thành bao tử có một hoặc nhiều lớp. Bề mặt trơn lán đôi khi có hốc, chỗ nhô ra với nhiều hình dạng, nếp gấp, gai hoặc mắt lưới. Bào tử hình thành trên túi mang bảo tử, khi trưởng thành không thấy cuống bao tử nhưng có thé thấy vết sẹo trên bề mặt do quá trình hình thành bao tử dé lại.
Bào tử chỉ Entrophospora có dạng hình cầu hay hình trứng, kích thước từ 180 - 360 um, màu vàng nhạt, cam nâu nhạt đến nâu đậm, thành bào tử thường có 3 lớp. Bao tử hình thành đơn lẻ trong dat, sinh ra từ trong cô của túi mang bao tử (túi mẹ). Cuéng bào tử phông lên và thăng, đôi khi không có cuống.
Bao tử chi Glomus mọc đơn lẻ hay thành chùm (sporocarp). Các bao tử thường có
dạng hình cầu, gần hình cầu hay bầu dục, kích thước từ 50 - 350 um, cuống thang, suôn, vuông góc với thành bào tử, đôi khi uốn cong. Bào tử có màu sắc đa dạng từ: trong suốt, vàng, vàng nâu, nâu đến nâu đen, các bào tử về già sẽ có màu đậm hơn so với còn non.
Thanh bao tử dày, thường có từ 1 - 3 lớp đôi khi nhiều hơn.
Bào tử chỉ Gigaspora sinh ra trong đất có dạng hình cầu hoặc gần như hình cau, hay hình trứng, có kích thước lớn. Bào tử mọc đơn lẻ, có màu trắng hay vàng rơm, bề mặt bào tử trơn phẳng, cuống bảo tử phình to ra dạng củ hành.
Bào tử chi Scutellospora được hình thành riêng lẻ, có dang hình cau, hình trứng hoặc không có định, màu sắc từ trong suốt, trắng, vàng, hơi hồng, đến xám hoặc nâu.
Thành bào tử có 2 lớp, cuống bào tử phình to, các ống mầm phát triển từ khiên mầm nằm ở vách trong cùng của thành bảo tử.
3.3.3. Nội dung 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nắm nội cộng sinh đến sinh trưởng của cây lúa ở các điều kiện mặn khác nhau.
3.3.3.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nắm nội cộng sinh đến sinh trưởng của cây lúa ở các điều kiện mặn khác nhau.
Thí nghiệm đơn yếu tố được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức với ba lần lặp lại. Một nghiệm thức đối chứng là NT 1 (DC +) bổ sung AM và 3 NT (2, 4, 6) không có bé sung AM ở các mức độ mặn (1%o, 2%o, 3%o) và các NT (3, 5, 7) đều được chủng AM và với hàm lượng độ mặn thay đổi (1%, 2%o, 3%o) và được thé hiện trong Bang 3.1. Số lượng bào tử nắm AM bồ sung vào các ly thí nghiệm là 250 bào
16
tử AM/ly/kg. Tổng số ly thí nghiệm: 10 ly/NT x 3 lần lặp lạt x 7 NT = 210 ly
Bang 3.1. Khảo sat sự cộng sinh của nam AM trên cây lúa ở các mức độ mặn Nghiệm thức Nội dung nghiệm thức
NTI(ĐC+) Cây lúa + AM NT2 Cây lúa + Độ mặn (1%o) NT3 Cây lúa + AM + Độ mặn (1%) NT4 Cây lúa + Độ mặn (2%o) NT5 Cây lúa + AM + Độ mặn (2%o) NT 6 Cây lúa + Độ mặn (3%o) NT7 Cây lúa + AM + Độ mặn (3%)
Giống lúa sử dụng là lúa IR50404. Hạt lúa được xử lý trước khi gieo, sau đó chọn những hạt mọc mầm gieo vào ly đã chuẩn bị sẵn, mỗi ly gieo 5 hạt lúa đã nảy mầm, sử dụng ly nhựa có kích thước 117 mm x đáy 85 mm x chiều cao 150 mm. Thí nghiệm được bồ trí trong nhà lưới, nước được tưới hằng ngày vào buổi sáng và chiều. Phân bón sử dụng trong các thí nghiệm là đạm (urê 46% N), MAP, bón phân xung quanh gốc
định kỳ vào các ngày thứ 7, 14, 21, 28 sau khi gieo hạt.
3.3.3.2. Theo đõi các chỉ tiêu
Chỉ tiêu sinh trưởng: tiến hành đếm số rễ lúa, số chồi, đo chiều cao cây (cm) và chiều dai rễ (cm) bằng thước đo, cân sinh khối tươi của rễ (g) bằng cân điện tử hai số lẻ,
ở các giai đoạn 14, 21, 28 và 35 ngày sau khi gieo hạt.
Chỉ tiêu nắm AM
Mật số bào tử trong đất: mẫu đất sau khi lấy sẽ tiến hành phân tách bằng phương pháp sàng ướt kết hợp ly tâm với dung dich sucrose và đếm tổng số bao tử trên các đĩa có chia 6 dưới kính soi nồi được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam 12560 - 1: 2018.
Tỷ lệ cộng sinh trong rễ: chọn ngẫu nhiên 2 g rễ, cắt thành các đoạn 1 cm và tiễn hành nhuộm với trypan blue. Quan sát ngẫu nhiên 100 đoạn rễ và ghi nhận tỷ lệ cộng sinh nam AM theo tiêu chuẩn Việt Nam 12560 — 2: 2018 có công thức:
ơ Tổng sộ rễ hiện diện AM
Tỷ lệ cộng sinh (%)=——————z z — x100 Tông sô đoạn ré quan sat
3.3.3.3. Phương pháp xác định sự hiện điện của nắm nội cộng sinh trong rễ
Sự hiện điện của nam nội cộng sinh trong rễ được nhận diện bằng cách tiến hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips và Hayman (1970). Rễ lúa sau khi thu dưới nhà lưới được rửa sạch dưới vòi nước dé loại bỏ đất.
Bước 1: cắt khoảng 2 g rễ thành từng đoạn ngắn khoảng 1 cm (có thé cắt đoạn rễ
thành nhiều lát mỏng dé dé quan sát cau trúc xâm nhiễm của nam). Ngâm rễ đã cắt trong dung dich KOH 10% khoảng 20 phút ở 80 °C dé tây tế bào chất trong rễ.
Bước 2: rửa mẫu rễ đến khi hết màu nâu rồi tiếp tục ngâm mẫu rễ trong dung dịch HCI 2% khoảng 10 phút để trung hòa KOH.
Bước 3: rửa mẫu rễ với nước rồi nhuộm với trypan blue 0,05%, 10 phút ở 80 °C.
Bước 4: rửa mẫu rễ với nước sạch, quan sát và ghi nhận cấu trúc xâm nhiễm ở độ
phóng đại 40x.
3.3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý và chuyền đổi bằng phần mềm Excel sau đó được xử lý thống kê và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm Minitab 16.
18