3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian bắt đầu làm từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 6 năm 2023. Đề tài được sinh viên nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Nam ăn va Nam dược liệu, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Qua thé nam Linh chi được thu thập từ nhà trồng nam của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2.2. Hóa chất - dụng cụ thí nghiệm
Nguyên liệu: lúa, cám bắp, cam gao, mat cưa cao su.
Hóa chất: môi trường thích hợp cho nam PGA, PGAY, vôi, nước cất, cồn 90°(CAS: 64-17-5), cồn 70°, agar (ROBIKA Hải Long 500g).
Dụng cụ và thiết bị: Ống nghiệm, dia petri, dao cấy, que cay, đèn cồn, bông gòn không thấm nước, nồi nau môi trường, bếp nấu, ca dong, chai thủy tinh, tủ cấy vô trùng TTS - V1000 (THIEN TRUONG SCIENTIFIC Co., Ltd), nồi hap khử trùng
(P&S KOREA), cân điện tử, th mat (Sanaky VH — 168K 160 lit), lò vi song
(Electrolux 20 lit EMM20K18GW), cân đồng hồ 30 kg (Nhơn Hòa).
3.3. Phương pháp thí nghiệm
3.3.1. Chiếu xạ tia gamma Co-60 với giống nắm Linh chi
Chuẩn bị môi trường để phân lập, làm thuần giống trước khi đem chiếu xạ tia gamma Co-60. Đối với phân lập giống nam Linh chi sử dụng môi trường:
Môi trường PGA: 200g khoai tây, 20g đường D-glucose, 20g agar và nước cat
vừa đủ 1000ml.
Đối với môi trường có khoai tây: Khoai tây được gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ và đô vào nồi khoảng 500ml nước cất nấu trong khoảng 20 phút thu phần khoai tây vào cốc đong, vớt bỏ bọt đi. Sau đó, cho các thành phần môi trường là đường D-glucose và agar vào cốc đong rồi thêm nước cất cho đủ 1000ml. Môi trường được cho vào cái ống nghiệm và đem hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Sau khi hấp xong, các ống nghiệm được đặt nghiêng dé dé quan sát tơ nam phát triển.
13
Liều lượng chiếu xa gamma Co-60 cho hệ sợi nam Linh chi được chiếu với các liều lượng gồm: 0,0 kGy (DC), 0,25 kGy, 0,5 kGy, 0,75 kGy, 1,0 kGy.
Sau khi có mẫu chiếu xạ, tiếp tục dé quan sát khoảng 1 - 2 ngày cho mau nắm ồn định. Các ống giống nam được chiếu xạ đồng thời cùng một thời điểm. thu nhận các liều lượng chiếu của nam và tiếp tục bồ trí các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Kỹ thuật nuôi trồng của nắm Linh Chi
3.3.2.1. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của nắm trên môi trường nhân giống cấp một
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường cấp một được sử dụng dé cấy chuyền các mẫu nắm:
Môi trường PGA: 200g khoai tây, 20g đường D-glucose, 20g agar và nước cất
vừa đủ 1000ml.
Môi trường PGAY: 200g khoai tây, 20g đường D-glucose, 20g agar, cao nam men và nước cất đủ 1000m1.
Đối với môi trường có khoai tây: Khoai tây được gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ và đồ vào nồi khoảng 500ml nước cất nấu trong khoảng 20 phút thu phần khoai tây vào cốc đong, vớt bỏ bọt đi. Sau đó, cho các thành phần môi trường là đường D-glucose, agar, cao nam men vào cốc đong rồi thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Môi trường được cho vào cái ống nghiệm va đem hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Sau khi hấp xong, đồ vào các đĩa petri đã hấp khử trùng khoảng 15 - 20 ml môi trường. Bảo quản các đĩa petri ở môi trường thoáng mát, tránh ánh sáng trực tiếp, điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 3 - 4 ngày xem có nhiễm nam mốc hay không, có thì cần loại bỏ ngay. Chọn những dia môi trường tốt, các ống giống PGA dé tiến hành cấy giống đã chiếu xạ để khảo sát.
Thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh trưởng và phát triển của nam chiếu xạ trên hai môi trường cấp một (PGA, PGAY) môi trường được bé trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố trên 5 nghiệm thức (5 liều lượng chiếu khác nhau). mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Cần 3 đĩa cho một liều lượng chiếu. Tổng cộng là 90 đĩa petri.
Các chỉ tiêu theo dõi
Thời gian tăng trưởng của tơ nam (ngày): theo dõi thời gian tơ nam bat đầu lan đến khi tơ nam lan kin đĩa petri.
Tốc độ tăng trưởng của tơ nam (cm/ngay) trên đĩa là hiệu số giữa chiều dài tơ nắm lan được với số ngày tăng trưởng.
14
Chất lượng của tơ nam dựa vào màu sắc, độ day tơ, độ phân nhánh của tơ nắm.
Các thí nghiệm trên hai loại môi trường với 5 liều lượng khác nhau được tiến hành cùng một thời điểm. So sánh các chỉ tiêu theo déi giữa các nghiệm thức.
Phương pháp xử lý số liệu thống kê trong các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Minitab 16. Phân tích phương sai (ANOVA) dé phát hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Sau đó tiến hành trắc nghiệm phân hạng (nếu có). Các biéu đồ được vẽ trong phần mềm Microsoft Excel.
Tốc độ lan tơ (cm/ngày), tốc độ lan tơ trung bình tính theo công thức
X=(ŒXI+X2+X3+... + Xn)/n
Trong đó có X là tốc độ lan tơ, n là số ngày khảo sát.
Từ kết quả, so sánh và chọn mẫu tốt nhất. Mẫu được chọn phải có tơ dày, đều, tơ lan nhanh nhất trên môi trường nhân giống cấp một thích hợp.
3.3.2.2. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của nắm trong môi trường nhân giống cấp hai
Tiến hành thí nghiệm
Sau khi xác định được liều chiếu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nam Linh Chi, tiép tục chọn các meo nấm của môi trường tốt hơn đã chọn được ở thí nghiệm 1 để tiếp tục cấy chuyền sang các chai môi trường nhân giống cấp hai là meo lúa bổ sung 5% cám bắp, mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần, mỗi lần 3 chai, tổng cộng có
45 chai.
Ngâm lúa với nước vôi dé loại bỏ tạp chất và chọn các hat lúa căng tròn, ít lép, vo kỹ hạt lúa bằng nước sạch và nấu đến cho hạt lúa nứt nanh, vớt ra để ráo nước, phối trộn theo tỉ lệ cám bắp, cám gạo như trên. Sau đó, trộn đều các thành phần của môi trường, cho vào chai thủy tinh đậy nút bông và đem hấp khử trùng 121°C trong 20 phút.
Lay ra dé nguội, kiểm tra môi trường sau khoảng 2 - 3 ngày trước khi cấy chuyền meo giống từ môi trường nhân giống cấp một sang.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm khảo sát sự sinh trưởng của nam Linh Chi được chiếu gamma Co-60 khác nhau được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố môi trường với 5 liều lượng chiếu, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai. Tổng cộng cần 45 chai.
15
Các chỉ tiêu theo dõi
Thời gian tang trưởng của to nam (ngày): theo đõi thời gian tơ nam bat đầu lan đến khi tơ nam lan kin dia petri.
Tốc độ tăng trưởng của tơ nam (cm/ngay) trên đĩa là hiệu số giữa chiều dài tơ nắm lan được với số ngày tăng trưởng.
Chất lượng của tơ nam được quan sát đánh giá dựa vào màu sắc, độ dày tơ, độ phân nhánh của tơ nam.
Các thí nghiệm trên cùng một loại môi trường với 5 liều lượng khác nhau được tiễn hành cùng một thời điểm. So sánh các chỉ tiêu theo dõi giữa các nghiệm thức.
Phương pháp xử lý số liệu thống kê trong các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Minitab 16. Phân tích phương sai (ANOVA) dé phát hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Sau đó tiến hành trắc nghiệm phân hạng (nếu có). Các biểu đồ được vẽ trong phần mềm Microsoft Excel.
Tốc độ lan tơ (cm/ngày), tốc độ lan tơ trung bình tính theo công thức
X=(XI +X2+X3+...+ Xn)/n
Trong đó có X là tốc độ lan tơ, n là số ngày khảo sát.
3.3.2.3. Khảo sát trên môi trường cơ chat bich phôi trồng nắm Linh Chi Tiến hành thí nghiệm
Sau khi khảo sát được sự sinh trường và phát triển của nam chiếu xạ trên môi trường nhân giống meo lúa, chọn meo của môi trường này tiếp tục cấy chuyền sang các bịch giá thê thí nghiệm, mỗi liều lượng chiếu cấy 10 bịch, chọn 3 bịch đánh giá các chỉ
tiêu khảo sát.
Môi trường cơ chất bịch phôi được chon dé trồng nam Linh Chi là 95,5% mun cưa cao su bồ sung 1,5% cám gạo, 3,0% cám bắp.
Xử lý nguyên liệu: Mạt cưa cao su được ủ với nước vôi trong 1%, sau đó được
đảo đều và được phủ bạt kín. Sau 7 ngày ủ thì chu kì 2 ngày đảo trộn một lần đề kiểm tra nhiệt độ và để mạt cưa cao su thoáng khí. Nhờ hoạt động của các vi sinh vật có lợi việc ủ nguyên liệu sẽ giúp phân giải, tạo thuận lợi cho hệ nắm phát triển sau này, làm bay hơi các tinh dầu có trong mat cưa, đồng thời quá trình ủ cũng giúp phân giải và biến đôi một phần nguyên liệu nhờ hoạt động của vi sinh vật, tạo nguồn thức ăn cho sợi nam sau này. Quá trình đảo trộn nhằm đảm bảo nồng độ oxy cho vi sinh vật phân giải hiểu khí, ngoài ra còn có tác dụng trộn đều nguyên liệu dé đống ủ được xử lý đồng đều cả
16
trong lẫn ngoài. Sử dụng cơ chat mat cưa cao su dé nuôi trồng là môi trường giúp cho hệ tơ nam sinh trưởng và phát triển tốt. Giống có tốc độ lan tơ trong môi trường cơ chat mạt cưa cao su nhanh sẽ giúp rút ngắn thời gian nuôi ủ tơ, giảm tỉ lệ tạp nhiễm.
Phối trộn giá thé: Cân trọng lượng giá thé theo tỉ lệ nêu trên. Tron đều các loại giá thé tông hợp với các chất dinh dưỡng và đóng vào các bịch PP chịu nhiệt, mỗi bịch chứa 1,2 kg nguyên liệu. Đóng bịch lại bằng nút và bông không thấm, dùng giấy bich cô nút. Hap khử trùng bằng nồi hấp phôi ở nhiệt độ 100 - 105°C thời gian 6 - 8 tiếng.
Sau 1 ngày khi giá thé nguội, dùng giống trên môi trường cấp hai (mỗi lần cấy lượng giống khoảng 3 muỗng cà phê) dé cấy vào các bịch giá thé ở liều chiếu như trên. Độ tuổi thích hợp nhất của giống là 13 - 15 ngày.
Sau khi cấy giống vào, các bịch phôi được ủ nằm ngang trên các kệ trong nhà ủ tối. Giai đoạn đầu hình thành quả thé: khi chỗ nút bông xuất hiện mam nắm tiến hành tháo giấy và nút bông và tiếp tục tưới nước dưới nền nhà, sau 4 ngày tiến hành kết hợp phun sương và tưới nền dé tạo độ âm 90 - 95%. Giai đoạn quả thé phát triển tạo độ 4m nhà trồng từ 85 - 95% bằng cách kết hợp tưới phun sương và tưới nền nhả trồng.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm khảo sát sự sinh trưởng của nam Linh Chi được chiếu gamma Co-60 được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố giá thé với 5 liều lượng chiếu (0,0 kGy, 0,25 kGy, 0,5 kGy, 0,75 kGy, 1,0 kGy), lặp lại 3 lần. Cần 10 bịch phôi cho mỗi nghiệm thức, tổng cộng 150 bịch phôi.
Các chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng của tơ nam (cm/ngay) trên đĩa là hiệu số giữa chiều dai tơ nắm lan được với số ngày tăng trưởng.
Trọng lượng tươi của qua thé (gram): Dùng cân điện tử dé cân trong lượng qua thé.
Đường kính của quả thé (cm): Do đường kính bằng thước kẻ.
Chiều dai cuống của qua thé (cm): Do đường kính bằng thước kẻ.
Hiệu suất sinh học (%): (Trọng lượng nam tươi / Trọng lượng cơ chất khô) x 100.
Các thí nghiệm trên cùng một loại môi trường giá thê với 5 liều lương khác nhau được tiễn hành cùng một thời điểm. So sánh các chỉ tiêu theo đõi giữa các nghiệm thức.
Phương pháp xử lý số liệu thống kê trong các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Minitab 16. Phân tích phương sai (ANOVA) dé phát hiện sự khác biệt giữa các
17
nghiệm thức. Sau đó tiến hành trắc nghiệm phân hạng (nếu có). Các biéu đồ được vẽ trong phần mềm Microsoft Excel.
Tốc độ lan tơ (cm/ngày), tốc độ lan tơ trung bình tính theo công thức
X=(XI +X2+X3+...+Xn)/n
Trong đó có X là tốc độ lan tơ, n là số ngày khảo sát.
Từ kết quả, đánh giá năng suất của quả thể sau khi chiếu xạ so với đối chứng 0,0 kGy.
18