3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ tháng 8/2022 đến tháng 4/2023.
Địa điểm: Khoa Khoa học Sinh học và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu
Nam Linh chi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Nắm ăn — nam dược liệu,
Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh hoc và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành
phố Hồ Chí Minh. Nam được sấy khô ở 50 °C + 5 °C cho đến khi độ âm còn dưới 17%
(theo quy định về độ 4m của dược liệu - Dược điển Việt Nam V). Nam Linh chi sau khi say được xay nhỏ và ray qua ray có kích thước lỗ ray là 0,5 mm dé chuẩn bị cho các thi nghiệm tiếp theo.
Bột cỏ ngọt được mua tại hiệu thuốc đông y Thuận Hưng đường Hải Thượng Lang Ông, phường 10, quận 5, thành phô Hồ Chi Minh.
Mật ong Viethoney được mua tại siêu thị Co.opmart thành phố Hồ Chi Minh.
Hình 3.1. Bột Linh chi. Hình 3.2. Bột cỏ ngọt. Hình 3.3. Mật ong.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Máy nghiền búa, tủ sấy (Memmert), Cân phân tích (Ohaus PA), lò nung (Nabertherm), nôi hap tiệt trùng (Autoclave), máy do UV-Vis, bếp điện (Mayso), bếp đun bình cầu (Joanlab), bình cầu, ống sinh hàn, hệ thống sinh hàn, thiết bị sấy thăng hoa (Harvest right), máy khuấy từ gia nhiệt (Stuart), bồn đánh sóng siêu âm (LY), chén độ
18
4m, cốc nung, bình hút 4m, cân điện tử, giấy lọc Whatman và các thiết bị, dung cụ thông
dụng trong phòng thí nghiệm.
3.2.3. Hoá chất
Hoá chat được dùng trong đề tài bao gồm: acid sulfuric (H2SO,), anthrone,
ethanol (C2HsOH), Maltodextrin (CAS No: 9050-36-6).
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polysaccharides trong nam Linh chỉ
3.3.1.1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu nấm Linh chi
Nắm linh chỉ được xay thành dạng bột và rây qua rây có kích thước lỗ rây là 0,5 mm sau đó tiến hành kiểm tra độ 4m, hàm lượng tro tổng số và hàm lượng polysaccharides tổng.
Chỉ tiêu độ 4m (theo TCVN 9741:2013).
Cân chính xác 2 g mẫu cho vào chén độ 4m (chén độ âm đã được sấy 105 °C, dé nguội ở bình hút âm, cân và ghi nhận khối lượng). Cho chén chứa mẫu vào tủ sấy, say ở nhiệt độ 105°C + 5 °C trong 4 - 6 giờ, sau đó dé nguội trong bình hút âm và ghi nhận khối lượng. Lặp lại nhiều lần đến khi chênh lệch trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt
quá 5 mg.
Độ 4m của mẫu được tính theo công thức sau:
X = [(mị -m;) x 100]/ m1 Trong đó:
X: Độ am (%);
mị: Khối lượng mau thử trước khi sấy (8);
ma: Khối lượng mẫu thử sau khi sấy (g);
Chỉ tiêu tro (phương pháp AOAC 900.02).
Cân chính xác 2 g mẫu cho vào chén sứ chuyên dùng xác định độ tro (chén được nung ở 550 °C, dé nguội và ghi nhận khối lượng). Cho chén chứa mẫu vào lò nung, nung ở nhiệt độ 550 °C — 600 °C trong khoảng 12 đến 18 giờ, đến khi mẫu được tro hoá hoàn toàn, sau khi nung, đặt chén trong bình hút ẩm, đề nguội và ghi nhận khối lượng.
Hàm lượng tro tổng số của mẫu được tính theo công thức sau:
19
A =[(M:—M¡}M:] x 100 Trong đó:
A: Hàm lượng tro tổng số (%);
Mi: Khối lượng chén nung (g);
M¿: Khối lượng mẫu phân tích (g);
Ms: Khối lượng chén va mẫu sau khi nung (g);
Định lượng polysaccharides tổng trong nắm Linh chỉ (phương pháp Acid Sulfuric
— Anthrone) (Sluiter và ctv, 2008)
Chuan bị mẫu: Cân 2 g mẫu bột linh chi chiết với dung môi là ethanol 50° trong 24 giờ, lọc qua giấy lọc thu được bả và dịch. Phan ba Linh chi được hấp thuỷ phân với HzSO¿ ở nhiệt độ 121 °C trong 1 giờ 30 phút. Hàm lượng polysaccharide trong mau Linh
chỉ được tính bằng tổng hàm lượng đường tan trong dịch chiết và hàm lượng polysaccharide trong dịch thuỷ phân bằng phương pháp Acid Sulfuric - Anthrone.
Polysaccharide thuỷ phân thành phân tử mono dưới acid đậm đặc và khử nước nhanh
chóng dé tạo thành Aldehyd glucorunic. Sau đó glucorunic aldehyde và anthrone ngưng tụ tạo thành dẫn xuất glucorunic, có màu xanh lam.
Xây dựng đường chuẩn:
Pha Anthrone: Cân 0,2 g Anthrone, hòa tan trong bình định mức, thêm H2SO, 96% vừa đủ 100 ml
Chuẩn bị mẫu chuẩn: chất chuẩn là D — Glucose Bảng 3.1. Nồng độ đường chuẩn glucose
Nông độ Glucose (mg/]) 0 30 60 90 120 150 Thể tích dung dịch Glucose stock (ml) 0 0,3 0.6 0,9 1,2 1,5
Nước cất (ml) 10 97 94 91 88 85 Pha dung dịch chuẩn (1000 mg/l): Can 0,5 g D-Glucose pha trong 500 ml nước cat.
Mỗi mẫu chuẩn lay 2 ml vào ống nghiệm, mỗi ông thêm 4 ml dung dich Anthrone đã pha và 2 ml dung dich HaSO¿ 96% rồi lắc đều. Sau đó đun cách thuỷ trong ở 100 °C trong 15 phút. Lay mẫu 100 mg/l phân tích UV — Vis ở chế độ toàn dải, xác định được bước sóng dung dịch hấp thụ cực đại là 624 nm. Tiếp theo đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ở bước sóng 624 nm rồi dựng đường chuẩn.
20
Phương trình đường chuẩn dựng được y = 0,0062x + 0,0134. Trong đó, y là độ hap thụ quang, x là nồng độ mẫu (mg/l). Phương trình đường chuẩn này có hệ số tương quan đạt r? = 0,998. Như vậy, hoàn toàn có thé sử dụng đường chuẩn nay trong phân
tích định lượng nhóm polysaccharides.
Thực hiện phản ứng:
09 y =0.0062x + 0.0134 Š R?=0.9984 _
0.8 — 0.7 :
0.6
0.5 ~ 0.4 at
0.3 —
ABS
0.1 ơ
0 &~
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Glucose (mg/L)
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn Glucose.
Cho 2 ml dịch mẫu vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm 2 ml H;SOx 96% và 4 ml dung dịch Anthrone rồi lắc đều. Sau đó dun cách thuỷ ở 100 °C trong 15 phút, dé nguội ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 624 nm.
Công thức tính kết quả:
W=(CxFx V)/[mx (1- w)|
Trong đó:
W: Hàm lượng polysaccharide trong mẫu (mg/kg);
C: Nong độ polysaccharide tính theo glucose từ đường chuẩn (mg/L);
F: Độ pha loãng;
V: Thé tich mau phan tich (ml);
m: Khối lượng mẫu phân tích (g);
w: Độ âm của mẫu phân tích (%);
21
3.3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng polysaccharides Nam Linh chi được trích ly trong cùng một điều kiện, có định các thông số, điều kiện dé dé dang cho quá trình nghiên cứu, sử dụng phương pháp đun hồi lưu, dung môi trích ly là nước. Dịch trích ly được lọc qua giấy lọc và tiến hành xác định hàm lượng polysaccharide thu được bằng phương pháp Anthrone-Sulfuric.
Các nghiệm thức về nhiệt độ trích ly được bố tri thí nghiệm theo bảng 3.2.
Bảng 3.2. Bồ trí thí nghiệm các nghiệm thức nhiệt độ trích ly Khối lượng mẫu (g) 10 Phương pháp ly trích Dun hồi lưu
Dung môi Nước Nhiệt độ trích ly (°C) 70 — 85 ~ 100
Ty lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) 1/20 Thời gian trích ly (phút) 90
3.3.1.3. Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly ảnh hưởng đến hàm
lượng polysaccharides
Các nghiệm thức tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly được bố trí thí nghiệm theo
Bảng 3.3. Bồ trí thí nghiệm các nghiệm thức tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly Khối lượng mẫu (g) 10
Phương pháp ly trích Dun hồi lưu
Dung môi Nước
Nhiệt độ trích ly (°C) Được chọn ở mục 3.3.1.2 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) 1/15 — 1/20 - 1/25
Thời gian trích ly (phút) 90
3.3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng polysaccharides Các nghiệm thức về thời gian trích ly được bồ trí thí nghiệm theo bảng 3.4.
22
Bảng 3.4. Bồ trí thí nghiệm các nghiệm thức thời gian trích ly Khối lượng mẫu (g) 10 Phương pháp ly trích Dun hồi lưu
Dung môi Nước
Nhiệt độ trích ly (°C) Được chọn ở mục 3.3.1.2 Ty lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) Được chọn ở mục 3.3.1.3
Thời gian trích ly (phút) 60 — 90 — 120
3.3.2. Nghiên cứu chế tạo sản phẩm trà hoà tan từ dịch chiết Linh chỉ 3.3.2.1. Phương pháp phối trộn sản phẩm
Tiến hành nghiên cứu công thức phối trộn sản phâm gồm có dịch chiết linh chi, dịch chiết cỏ ngọt và mật ong. Các công thức thu được sẽ được phân tích đánh giá chất lượng cảm quan về các tiêu chí mùi, vị theo TCVN 3215:79.
Ly trích 1g bột cd ngọt với 100ml nước ở 100°C trong 15 phút thu được dich cỏ
ngọt, dich cỏ ngọt được lọc qua giấy lọc dé loại bỏ phan cặn.
Bảng 3.5. Chỉ tiêu đánh giá cảm quan các công thức phối trộn sản phẩm
Công thức Tỷ lệ thể tích dịch chiết linh chỉ: dịch Chỉ tiêu đánh giá chiết cỏ ngọt: mật ong (ml)
er 6:14:2
Mùi CT2 §:13:1,5
Vi
CT3 10:10:1 CT4 12:8:0,5
3.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn chất mang đến độ ẩm, hiệu suất thu hồi sản phẩm sau sấy thăng hoa, giá trị cảm quan của sản phẩm
Tiến hành khảo sát tỷ lệ phối trộn Maltodextrin lần lượt là 10%, 15%, 20% và 25% với công thức đã được chọn ở mục 3.3.2.1 sau đó đem đi sấy thăng hoa với các thông số là (các thông số sây thăng hoa dựa vào nghiên cứu của Phạm Thị Hà Vân và
ctv, 2021)
23
Lạnh đông ở -20°C trong 10 giờ
Say thăng hoa ở 45°C trong 38 giờ
Bảng 3.6. Chỉ tiêu đánh giá các nghiệm thức phối trộn Maltodextrin
Nghiệm thức Tỷ lệ Maltodextrin (%) Chỉ tiêu đánh giá
NTI 10 Độ âm NT2 15 Hiệu suất thu hồi
Đánh giá cảm quan (vi, NT3 20 ơ
mùi, màu, độ trong) NT4 25
Công thức tính hiệu suất thu hồi sản phẩm ( công thức tính dựa vào nghiên cứu
của Phạm Thị Hà Vân và ctv, 2021):
H=(mz/m)) x 100 Trong do:
H là hiệu suất thu hồi sản phẩm (%);
m; là khối lượng ban đầu (8):
m2 là khối lượng sau khi sấy (g);
Phương pháp đánh giá cảm quan sản pham theo TCVN 3215:79
Khi đánh giá cảm quan sản phẩm thực pham bằng phương pháp cho điểm theo TCVN 3215 — 79 thì tat cả các chỉ tiêu cảm quan hay từng chỉ tiêu riêng của sản pham ta dùng hệ điểm 20 dé xây dựng 1 thang thống nhất 6 bậc 5 điểm (từ 0 đến 5) trong đó điểm 0 tương ứng với mức chất lượng sản phẩm bị hỏng, còn từ 1 — 5 tương ứng với mức khuyết tật giảm dan. Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có lỗi nao trong tính chất nhận xét, sản phẩm có tính chất tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó.
Sản phâm được đánh giá theo các chỉ tiêu: trạng thai, màu sắc, mùi, vi.
24
Bảng 3.7. Chỉ tiêu đánh giá cảm quan theo TCVN 3215:79
STT Mức Điểm
1 Tét 18,620 2 Kha 15,2+18,5
3 Trung binh 11,2+15,1
4 Kém 7,2+11,1
5 Rat kém 4,0+7,1
6 Hu hong 0,0+3,9
Số lượng người tham gia khảo sát là 30 người, độ tuôi từ 20 tuổi đến 50 tuổi. San phẩm đạt chất lượng khi điểm trung bình chưa có trọng lượng của một chỉ tiêu bất kì phải đạt nhỏ nhất là 2,8 và điểm chất lượng không nhỏ hơn 11,2. Nếu hội đồng thống nhất cho một chỉ tiêu nào đó 0 điểm thì điểm chung bằng 0 và sản phẩm coi như bị hỏng.
Nếu thành viên nào cho điểm lệch quá 1,5 điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng thì điểm của thành viên đó bị loại.
3.3.3. Đánh giá chất lượng trà thành phẩm
Chất lượng của sản phẩm trà hoà tan Linh chi được đánh giá thông qua phân tích các chỉ tiêu về độ ẩm, tro tong số, chỉ tiêu vi sinh vật, chi tiêu kim loại nặng.
3.3.3.1. Độ âm được xác định theo TCVN 9741:2013 3.3.3.2. Tro tong số được xác định theo TCVN 5253:1990
Cân chính xác 5 g mẫu trà hoa tan chén sứ chuyên dùng xác định độ tro (chén
được nung ở 550 °C, để nguội và ghi nhận khối lượng). Dàn đều mẫu trên đáy chén và đốt nhẹ trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hết. Chuyên chén sứ vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 550 đến 600 °C trong 2 giờ 30 phút, đến khi mẫu được tro hoá hoàn toàn.
Làm nguội chén sứ trong bình hút âm khoảng 40 phút và đem cân.
Hàm lượng tro tổng số của mẫu (X) tính bang phan trăm theo công thức:
X=Bx 100/[A x (1 —0,01b)]
Trong đó:
A: Khối lượng mẫu dùng dé phân tích (g);
25
B: Khối lượng tro lay được (g);
b: Độ âm của mẫu phân tích (%);
3.3.3.3. Chỉ tiêu vi sinh vật theo TCVN 7975:2008
Gửi mẫu tại viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường ĐH
Nông Lâm Tp.HCM.
Bảng 3.8. Các chỉ tiêu đánh giá vi sinh trong sản phẩm
Chỉ tiêu Phương pháp thử
Tổng số vi khuẩn hiếu khí TCVN 4884-2:2015 Coliforms TCVN 6848:2007
Salmonella sp. TCVN 4829:2005
Tổng nam men — nam mốc TCVN 8275-1:2010
3.3.3.4. Chi tiéu kim loai nang theo TCVN 7975:2008
Gửi mau tại viện nghiên cứu Công nghệ sinh hoc và Môi trường, trường DH
Nông Lâm Tp.HCM.
Bảng 3.9. Các chỉ tiêu đánh giá kim loại nặng trong sản phẩm
Chỉ tiêu Phương pháp thử
Cadmi (Cd) EPA SW — 846/METHOD 3050B
Chi (Pb) EPA SW — 846/METHOD 3050B
Thuy ngân (Hg) Quang phé hap thu nguyén tir 3.3.4. Xử ly số liệu
Số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel. Tat cả NT được thực hiện ít
nhất 2 lần lặp lại, kết quả thực hiện dưới dạng trung bình + độ lệch chuẩn. Các NT được đánh giá có sự khác biệt về thống kê thông qua phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA one-way) với kiểm định Tukey (mức ý nghĩa p < 0,05).
26