2.1. Thời gian và địa diém
2.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2020, đến tháng 4/2022.
2.1.2. Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu:
Chợ Linh Trung, phường Linh Trung, thành phố Thủ Đức
Chợ ca Lagi, thị xã Lagi, tinh Bình Thuận
Chợ cá Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh
Chợ Bến Đình, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa- Vũng tàu
Địa điểm xét nghiệm: phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh truyền nhiễm và Thú y cộng đồng, Khoa Chăn nuôi — Thú Y, trường Đại học Nông Lâm, thành phó Hồ Chi Minh.
2.2. Đối tượng khảo sát
Giun sán trên cá thu thập được.
2.3. Bố trí thu mẫu
Các mẫu cá nguyên con bao gồm: Decapterus maruadsi (cá nục sò), Seriola
dumerili (cá cam), Auxis thazard (cá ngù) và Rastrelliger kanagurt (cá bạc ma) được
thu thập ở bốn chợ Linh Trung, chợ Lagi, chợ Cần Giờ và chợ Bến Đình. Ở mỗi chợ tiền hành thu thập khoảng 30 mau cá mỗi loại. Chia thành các dot lay mau, mỗi lần
lây mâu ngau nhiên.
17
2.4. Nội dung nghiền cứu
Nội dung 1: khảo sát tỉ lệ nhiễm các loại giun san trên những mẫu cá được thu
thập.
Nội dung 2: định danh các loài ấu trùng Anisakis spp. bằng kỹ thuật sinh học
phân RFLP.
2.5. Vật liệu nghiên cứu
Máy móc thiết bị: Tủ -20°C, tủ lạnh, tủ trữ mẫu và hóa chất, máy PCR, máy ly tâm, may vortex, bộ nguồn và bổn điện di, lược gel, khuôn đồ gel, máy đọc gel
(Gel Mart — Dlab, Mỹ), ...
Dụng cụ: kéo, ray, phễu tam giác, giá đỡ, micropipet, đầu tuýp, và
eppendorf....
Hóa chất: bộ kit li trích DNA (DNA IQTM System kit, Promega, My), kit PCR (Gotaq® Green Master Mix, Nuclease free water - Promega, My), hóa chat dùng trong điện di bao gồm green gel, dung dịch đệm TBE 1X, agarose, Ladder (L100, Promega) va enzyme cắt giới han (Hinfl, Hhal -Thermo) va dung dich dùng trong phan ứng enzyme cắt giới han (restriction enzyme buffers).
2.6. Phuong pháp nghiên cứu
2.6.1. Nội dung 1: khảo sát tỉ lệ nhiễm các loại giun sán trên các mẫu cá được
thu thập
2.6.1.1. Đối tượng khảo sát
Giun san trên cá thu thập
2.6.1.2. Phương pháp mé khám
Cá được mô khám toàn diện bắt đầu từ lỗ huyệt đến miệng (Skrjabin, 1928).
Sau đó tách riêng các bộ phận nội tạng và xem trực tiếp bằng mắt thường hoặc soi
dưới kính lúp tìm giun tròn ký sinh.
2.6.1.3. Phương pháp thủy phân bằng enzyme pepsin
Dùng phương pháp thuỷ phân bang enzyme pepsin dé tìm các mẫu giun san kích thước nhỏ còn sót lại ở trên cơ của cá theo phương pháp thuỷ phân bằng enzyme pepsin. Hỗn hợp dung dich thủy phân bao gồm: 10g pepsin, 16mL HCl 37% và 2L
18
nước. Cho 100g phần cơ cá vào dung dịch thủy phân và ủ khuấy 44°C duy trì trong suốt quá trình hoạt động.
Dich mẫu được ủ khuấy cho đến khi phan cơ cá bị phân hủy hoàn toàn khoảng 30 phút đến 1gid. Quá trình tiêu cơ được xem là đạt yêu cầu nếu lượng mẫu ban đầu
còn lại trên rây lọc không quá 5%.
Dịch mẫu được lọc qua rây có kích thước mắt lưới 180 microm được đặt trong phéu thủy tinh hình nón. Tráng cốc va ray bằng dung dịch tiêu cơ.
Các loài giun san thu thập được sẽ được phân loại sơ bộ hình thái dựa theo đặc
điểm cấu tạo đề phân biệt giun tròn, giun đầu gai hay sán. Những ấu trùng giun tròn
được thu thập và bảo quản trong từng eppendorf 1,5 mL chứa dung dịch ethanol 70°
và lưu trữ ở nhiệt độ -20°C cho đến khi dùng kỹ thuật PCR/RFLP dé định danh loài
giun tròn.
2.6.1.4. Phương pháp xác định Anisakis ssp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR Mẫu ấu trùng giun tròn được tách chiết DNA bằng kít DNA IQ TM (Promega, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất (xem phụ lục số 2). Sau ly trích, những mẫu DNA sẽ được PCR dé xác định loài Anisakis spp.
Bang 2.1. Trình tự đoạn mỗi dùng trong phản ứng PCR định danh loài Anisakis Môi Trinh tự môi (ITS1, 5.8 S và ITS2) Kích thước sản phẩm
NC5 5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’
960 bp NC2 5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3?
(Zhu và ctv, 1998)
19
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.
Gotaq G2 12,5 uL Nuclease free water 8,5 nL NCS primer (10 nM) 1 pL NC2 primer (10 nM) 1 pL
Mau DNA 2 pL Tổng cộng 25 HL
Bang 2.3. Qui trình luân nhiệt của PCR dùng chan đoán loài Anisakis Tiền biến tính 2 phut/95°C
Khuếch đại 30 giây/95°C
30 giây/55°C 35 chukì 75 giây/72°C
Kéo dài 7 phút/72°C
(Chen và Shih, 2015)
Các sản phâm PCR được điện di trên gel agarose 1,0%, nguồn điện 100V trong 40 phút và được nhuộm bằng thuốc nhuộm green gel. Kết quả điện di được đọc dưới ánh sang epi blue bước sóng 470 nm. Mẫu cho kết quả đương tính với Anisakis spp.
khi sản phâm PCR có kích thước sản phẩm khoảng 960 bp (Zhu và ctv, 1998).
2.6.1.5. Chỉ tiêu khảo sát
Tỉ lệ cá nhiễm giun sán theo nguồn gốc mẫu, loài cá, tần số xuất hiện tại cơ
quan kí sinh trên cá.
Cường độ nhiễm (CDN) giun tròn ký sinh số cá thể giun tròn trên loài vật chủ bị nhiễm loài giun tròn đó.
- CDN thấp nhất (min): số lượng giun tròn ký sinh ít nhất trên 1 vật chủ.
20
- CDN cao nhất (max): số lượng giun tròn ký sinh nhiều nhất trên 1 vật chủ.
Ti lệ cá nhiễm Anisakis spp. theo nguồn gốc mẫu và theo loài cá.
2.6.2. Nội dung 2: Định danh các loài ấu trùng Anisakis bằng kỹ thuật sinh học
phan tử RFLP
2.6.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các ấu trùng dương tính với Anisakis spp. bang kỹ thuật PCR được tiến hành định danh loài bằng kỹ thuật enzyme cắt giới hạn (RFLP).
2.6.2.2. Phương pháp
Tất cả những mẫu PCR dương tính với Anisakis spp. được sử dụng để tiến hành định danh loài bang enzyme cắt giới hạn Hinfl và Hhal.
Bảng 2.4. VỊ trí nhận dạng của enzyme cắt giới hạn
Enzyme giới hạn Trình tự nhận dạng
; 5... GANTC...3
Enzyme Hinfl 3...CTNAG...5' 5...GCGC...3 Enzyme Hhalzy 3... C@CG...5
Bang 2.5. Thành phan các chat trong phan ứng enzyme cắt giới han (RFLP) Thanh phan Thé tich sir dung
10x buffer 1,5 pL Enzyme Hinfl (10 U/uL) 0,5 pL Enzyme Hhal (10 U/nL) 0,5 nL
Mau dương tinh PCR 10 uL
Nuclease free water 3uL
Tổng cộng 15 pL
21
Tiến hành ủ hỗn hợp cắt enzyme ở 37°C trong 2 giờ 30 phút. Sau đó điện di trên gel agarose 3% và nhuộm bang green gel. Đọc kết quả dưới ánh sáng epi blue bước sóng 470 nm. Kết quả sản phẩm sẽ được so sánh với kích thước của các loài ở
Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Kích thước của các vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) sau khi sử
dụng enzyme cắt giới hạn.
ITS sau khi dùng enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn Hinfl Hhal
A. pegreffii 34, 67, 235, 284, 331 419, 532 A. simplex ss 34, 67, 235, 615 419, 532 A. simplex/pegreffii hybrid 34, 67, 235, 284, 331,
genotype 615 419 532
A. simplex C 34, 67, 237, 615 142, 279, 532 A. ziphidarium 34, 273, 292, 332 413, 518 A. physeteris 34, 241, 263, 360 385, 513 A. typica
A. spA
Pseudoterranova spp. (P.
decipiens ss.)
34, 328, 594 34, 269, 288, 335
35, 179, 693
103, 153, 180, 212, 308 137, 272, 517
413, 493 (Community Reference Laboratory for Parasites, 2020) 2.6.2.3. Chi tiêu khảo sát
Kết quả định danh loài Anisakis spp. và tỉ lệ nhiễm Anisakis spp. trên các mẫu cá thu thập theo nguồn gốc chợ, loài cá.
2.7. Phương pháp xử lí số liệu
Tỉ lệ nhiễm theo địa phương thu mẫu, loài cá và so sánh bằng trắc nghiệm Chi- square bằng phần mềm Excel 2019 và Minitab 17.0. Giá trị p<0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê.
22,
Chương 3