2.1 Nội dung nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Thu thập, phân lập, định danh nắm AM trong đất trồng cây họ cà và đánh giá khả năng tái cộng sinh của nắm nội cộng sinh trong điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng hạn chế nắm Fusarium solani gây bệnh trên cà chua của nắm nội cộng sinh AM trong điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng hạn chế tuyên trùng Meloidogyne spp. gây u sưng trên rễ cà chua của nắm nội cộng sinh AM trong điều kiện nhà lưới.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 09 năm 2022 đến tháng 03 năm 2023 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
Dung dich polyvinyl-lactose-glycerol (PVLG): 100 ml nước cat + 100 ml acid lactic + 10 ml glycerol + 16,6 g polyvinyl alcohol, hỗn hợp được đặt trên bếp từ va khuấy đều ở nhiệt độ 60°C trong 4 giờ.
Dung dịch thuốc thử Melzer: 100 ml nước cất + 100 g chloral hydrate + 1,5 g iodine + 5 g potassium iodide, trữ trong chai tối.
Pha dung dịch nhuộm tryphan blue 0,05% bằng dung dich lactic acid glycerol-
acetic acid 5% (tỉ lệ 12 : 1 : 1) và tryphan blue.
Nguồn nam AM được thu thập, phân lập trên ca chua, cà tím và ớt ở ba huyện Bình Chánh và Hóc Môn của Thành phố Hồ Chí Minh.
Giá thé trồng cây gồm đất mặt và xơ dừa với tỉ lệ 1: 1 đem hap khử trùng ở
121°C trong 15 phút. Chậu thí nghiệm có kích thước 25 cm x 20 cm x 20 cm và lượng
đất thí nghiệm/ chậu là 5 kg đất.
Cà chua, cà tím và ớt được gieo từ hạt giống cà chua lai F1 của công ty TNHH
East West seed.
Phân bón NPK 16 - 16 - 8 + TE của Công ty Cổ phần Phân bón Bình Điền (Dam tổng số (Nis): 16%; Lân hữu hiệu (PzOsm): 16%; Kali hữu hiệu (KzOm): 8%; Lưu huỳnh (S): 5%; Kẽm (Zn): 120ppm; Bo (B): 120ppm; Mangan (Mn): 60ppm; Độ am:
<2,5%)
Nguồn nam AM ở thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3 gồm 2 chi nam Glomus và Acaulospora được kê thừa từ thí nghiệm 1 và được nhân nguồn theo từng chi trên cây cả chua, cả tím, ớt và bắp tại nhà lưới thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Nguồn nam Fusarium solani đã được phân lập trên ca chua bi bệnh va được git nguồn tại phòng Bệnh Thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Nam Fusarium solani sẽ được cấy trên môi trường tổng hợp PDA (Potato Destrose Agar) và được tăng sinh trong môi trường tổng hop SDB (Sabouraud Destrose Broth) thu bao tử sau 6 - 7 ngày nuôi cấy. Nồng độ bào tử lây nhiễm 10” CFU/ ml được phòng Bệnh Thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
Chuan bị nồng độ bao tử: bao tử được đếm bằng buồng đếm hồng cầu Thomas.
Mật số bào tử được tính theo công thức:
(4000 x a x 10° x 10") b
D= x 100
Trong do:
D: số bào tử/ ml
a: số lượng bào tử trong 16 ô lớn b: số ô nhỏ trong 16 ô lớn
n: nồng độ pha loãng của dung dich bào tử.
Tuyến trùng: thu thập và phân lập nguồn tuyến trùng Meloidogyne spp. tại các vườn tiêu ở Đồng Nai có triệu chứng bị u sưng ở rễ. Nguồn tuyến trùng Meloidogyne
Spp. sau khi phân lập được nhân nuôi trên cây cà chua. Chăm sóc, tưới nước thường
xuyên cây cà chua. Sau khi lây nhiễm tuyến trùng khoảng 8 - 10 tuần thì tiến hành nhồ cà chua, thu bọc trứng ủ nở thành J2 sau đó đếm mật số tuyến trùng dé chuẩn bị làm nguồn lây nhiễm.
2.4 Phương pháp thí nghiệm
2.4.1 Thí nghiệm 1: Thu thập, phân lập, định danh nắm AM trong dat trồng cây họ cà và đánh giá khả năng tái cộng sinh của nam nội cộng sinh trong điều kiện
nhà lưới
2.4.1.1 Thu thập, phân lập, định danh nắm nội cộng sinh trong đất trồng cây họ
cà ở Hóc Môn và Bình Chánh
Số mẫu thu thập là 40 mẫu đất trên ba loại cây trồng là cả tím, ớt, ca chua tại huyện Hóc Môn và Bình Chánh. Mẫu đất được lay 6 tầng đất có độ sâu 0 - 20 cm và cách gốc 10 - 30 cm. Tiến hành lấy 5 điểm theo đường chéo góc ở mỗi vườn (bao gồm 4 góc và 1 điểm ở trung tâm vườn). Mỗi điểm lấy 1 kg đất rồi trộn đều với nhau và ghi tên mẫu (tên cây trồng + số thứ tự mẫu lấy).
Mẫu đất sau khi thu thập được chia đôi, một phần phục vụ cho việc phân lập và định danh; một phan dùng cho việc giữ và nhân nguồn trên cà chua, ca tím, ớt và bắp.
2.4.1.2 Đánh giá khả năng tái cộng sinh của nắm nội cộng sinh trong điều kiện
nhà lưới
Hạt cà chua, cà tím và ớt được ngâm trong nước ấm với tỷ lệ 3 sôi : 2 lạnh trong 2 giờ sau đó vớt ra và cho vào chiếc khăn 4m, ủ tối ở nhiệt độ 25 - 30°C cho đến khi hạt nứt nanh và gieo hạt cà chua trong khay, khi cà chua được 2 - 3 lá thật sẽ cho ra chậu. Cà chua, cà tím và ớt sau khi ra chậu sẽ được tiến hành chăm sóc tưới nước day đủ và được bón phân NPK 16-16-8 + TE 10 ngày/ lần. Mật số bào tử được chủng vào chậu thí nghiệm: 10 bào tử/ 50g đất (1000 bào tử/ chậu/ 5 kg dat). Bao tử được chủng vào chậu thí nghiệm sau khi cà chua ra chậu một ngày. Mỗi loại cây sẽ trồng 15 chậu và lấy chỉ tiêu ở các mốc thời gian theo dõi là 14, 21 và 28 ngày sau chủng nắm AM.
2.4.1.3 Cách thức tiến hành
Phương pháp tách bào tử
Bao tử được tách khỏi đất theo kỹ thuật sang ướt (wet sieving) kết hợp với ly tâm trong dung dich sucrose (50%) của Brundrett và ctv (1996) (có thay đổi).
Bước 1: Can 100 g đất, loại bỏ các hạt đá to và rác thô, cho vào cốc chứa 500 ml nước, khuấy đều và dé lắng khoảng 3 - 5 phút.
Bước 2: Gan dịch qua một ray có kích thước lần lượt là 1000 um, 500 wm và 40 um. Quá trình lọc được lặp lại nhiều lần đến khi nước trên sàng có mau trong.
Bước 3: Thu phan đất va bào tử trên ray 40 um cho vào các ống ly tâm thé tích 50 ml. Sau đó cho dung dich sucrose (50%) vào 2/3 ống ly tâm đã chứa mẫu va lắc đều.
Bước 4: Mẫu được ly tâm với tốc độ 2000 vòng/ phút (trong 5 phút).
Bước 5: Hút dịch nồi cho qua ray 40 um và rửa đường sucrose dưới vòi nước.
Bước 6: Thu bao tử trên ray 40 jum, quan sát và đếm số bào tử dưới kính soi nổi Phương pháp xác định sự hiện diện của nắm nội cộng sinh trong rễ
Sự hiện diện của nam nội cộng sinh trong rễ được nhận diện bằng cách tiến hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips và Hayman (1970) (có một số thay đôi).
Bước 1: Cắt rễ thành từng đoạn ngắn (1 cm), tiếp tục cắt đoạn rễ thành nhiều lát mỏng. Ngâm những lát rễ trong dung dịch KOH (10%) khoảng 20 phút (6 80°C).
Bước 2: Rửa mẫu rễ đến khi hết màu nâu rồi tiếp tục ngâm mẫu rễ trong dung dịch HCl (2%) khoảng 10 phút dé trung hòa KOH.
Bước 3: Rửa mẫu rễ với nước rồi nhuộm với Tryphan blue (0,05%), 10 phút (80°C).
Bước 4: Rửa mẫu rễ nhiều lần với nước sạch, quan sát và ghi nhận cau trúc xâm nhiễm dưới kính hiển vi.
Sự hiện diện của nắm nội cộng sinh (AM) trong rễ được nhận diện bằng cau trúc phân nhánh của hệ sợi nam, cấu trúc dạng bụi va túi cua nam AM khi nội sinh vào trong mô rễ. Ngoài ra, quá trình định danh các chỉ nắm AM còn dựa trên sự bắt màu của thuốc nhuộm (Tryphan blue).
Đánh giá ty lệ nhiễm nắm nội cộng sinh (AM) theo công thức = Tổng số đoạn rễ hiện điện nam/Téng số đoạn rễ quan sát) x 100.
Định danh bào tử nắm nội công sinh (AM) dựa theo hình thái học (dang bao tử và cau trúc hệ sợi nắm, bụi và túi)
Nhận dạng nắm nội công sinh dựa vào hình dạng bào tử theo mô tả của Gerdemamn (1963), Gerdemann va Trappe (1974). Dựa vào hình thái xâm nhiễm của sợi nấm túi, cầu trúc cộng sinh theo mô tả của Brundrett và ctv (1996).
Chi Glomus
Bao tử thường có dang hình cầu, hình bầu dục có thể mọc thành chùm hoặc
đơn lẻ. Màu sắc đa dạng: trong suốt, trắng, vàng, cam, nâu đỏ. Bào tử có vách
day, cấu trúc nhiều lớp. Cuống bao tử thang, gắn trực tiếp với vách theo kiểu vuông
góc.
Dang xâm nhiễm trong rễ: dạng cộng sinh của chi Glomus bắt màu tương đối
đậm với tryphan blue. Sợi nam tuong đối thắng nằm dọc theo tế bào, khi phân nhánh
có dạng hình chữ H mọc về 2 phía. Bui của nam thường phân nhánh nhỏ, đôi khi cũng dày đặc trong tế bào. Chi Glomus thường xuất hiện túi trong rễ cây chủ. Túi thường có dạng hình bầu dục, vách day.
Chi Acaulospora
Bao tử thường có dang hình cau, hình bau dục hay hình elip, bên trong chứa nhiều chất dầu. Bào tử có màu trong suốt, trắng, vàng, nâu đỏ. Thanh bao tử có thể có một hoặc nhiều lớp. Bào tử được hình thành bên trên một túi mang bảo tử vách mỏng, khi trưởng thành bào tử không có cuống. Trên bao tử có thé xuất hiện một vết sẹo và dấu vết tiêu biến của sợi nắm khi hình thành bào tử.
Dạng xâm nhiễm trong rễ: nam Acaulospora bắt màu kém với tryphan blue.
Sợi nắm ở vỏ ngoài thường có nhiều nhánh và có dạng phân nhánh đặc trưng tại điểm vào. Sợi nắm nội bào nhỏ, chứa nhiều giọt dầu. Bụi phân nhánh nhỏ gọn hoặc đôi khi dày đặc trong tế bào. Một số loài Acaulospora có sự xuất hiện túi trong tế bao với dạng gần giống hình chữ nhật.
Chỉ Gigaspora
Bào tử trong đất lớn, có dạng hình cầu, gần giống hình cầu hình trứng hoặc không đều. Bào tử có thường có màu trắng, vàng nhạt. Cuống bào tử thường
phinh to dạng củ hành.
Dạng xâm nhiễm của chi Gigaspora sợi nam to, vách dày và bắt màu đậm với tryphan blue. Bụi nắm thường có thân kéo dài và phân nhánh dày đặc trong tế bào.
Không xuất hiện túi trong quá trình xâm nhiễm. Soi nam ở vỏ ngoài thường có những tế bào phụ trợ nhỏ đính kèm với dạng cầu (có gai) mọc thành chùm.
Glomus tenue Glomus
he
=
Hình 2.1. Dang cộng sinh của một số giống nam AM
(Brundrett và ctv, 1996)
Phương pháp định danh bào tử bằng sinh học phân tử
Sau khi tiến hành kiểm tra khả năng cộng sinh của nắm AM. Chọn hai chỉ nam có tần suất xuất hiện trong đất va tỷ lệ cộng sinh bên trong rễ cao nhất dé tiền hành định danh sinh học phân tử. Mẫu chứa chi nam Acaulospora được ky hiệu là MI và mau chứa chi nam Glomus được ký hiệu là M2.
Bào tử sau khi được định danh hình thái sẽ được ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp primer AML1/AML2.
Quy trình ly trích DNA:
Bước 1: thu 150 bào tử nam của từng chi (giống nhau về mặt hình thái, màu sac và kích thước) cho vào tube 1,5 ml sạch, sau đó nghiền bào tử.
Bước 2: thêm vào 100 uL Lysis buffer (Tris - HCl 0,1 M; EDTA 0,01 M;
NaCl 0,5 M; SDS 1%; pH = 8), tiếp tục nghiền mẫu nam. Bồ sung thêm 100 pL
Lysis buffer. Sau đó vortex và ủ trong một giờ ở 65 °C.
Bước 3: thêm 300 uL Chloroform - Isoamyl alcohol (25:24: 1) vào dung dịch
vừa thu được. Sau đó vortex và ly tâm hỗn hợp trong 5 phút với 13000 vòng/ phút.
Bước 4: thu lay dịch nổi sau khi ly tâm và cho sang tube mới. Thêm 200 pL
dung dịch Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol (25: 24: 1) vào dung dịch vừa
thu được. Vortex và ly tâm hỗn hợp trong 5 phút với 13000 vòng/phút.
Bước 5: thu lấy dịch nồi và chuyển sang tube mới. Thêm 100 uL dung dich Isopropanol và 3 pL Sodium acetate hydrate. Đảo nhẹ cho DNA tủa hoan toàn. U trong một giờ ở - 20 °C. Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút với 13000 vòng/phút. Dé dịch nồi.
Bước 6: thêm 600 uL Ethanol 70% lạnh vào hỗn hợp. Ly tâm trong 3 phút, 13000 vòng/phút, bỏ dịch nồi. Thực hiện lặp lại hai lần sau đó mở tube dé DNA
khô tự nhiên.
Bước 7: thêm 30 wL TE buffer và bảo quản ở - 20 °C.
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp primer AML1/AML2, sản khuếch đại
vùng trình tự SSU - rRNA có kích thước khoảng 800 bp (Lee và ctv, 2008).
Bang 2.1. Thành phần cho một phan ứng PCR
Thành phần Nông độ gốc Nông độ cuỗi Thê tích (uL)
Master Mix 2X 1X 6,25 Primer xuôi 10 pM 0,25 uM 0,25 Primer ngược 10 pM 0,25 uM 0.25 HạO 4,75 DNA 1
Tổng thể tích 135
Trinh tự nucleotide 5’ - 3’ của cặp mỗi AMLI/AML2:
Primer AMLI: 5° ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA 3?’
Primer AML2: 5° GAACCCAAACACTTTGGTTTCC 3’
Bang 2.2. Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR với cap primer AML1/AML2
Giai doan Nhiệt độ Thời gian Số chu kì Tiền biến tinh 94°C 3 phút 1
Bién tinh 94°C 1 phút Bắt cặp 50°C 1 phút
Kéo dai We 1 phút 30
Hậu kéo dài TC 10 phut
Giữ mau 4°C 1
San phẩm PCR sau điện di được gửi giải trình tự hai chiều tại Công ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, TP. Hồ Chí Minh), kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm Bioedit để có được trình tự nguyên vẹn của từng loài nam. Trình tự sau khi xử ly sẽ được so sánh với trình tự của các loài nắm khác trên ngân hàng dit liệu gen NCBI bằng BLAST nucleotide nhằm xác
định loài.
2.4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi
s* Ty lệ nam AM cộng sinh (%): Bộ rễ của cà chua sau khi sau khi thực hiện xong các chỉ tiêu sinh trưởng được tiến hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips và Hayman (1970) có chỉnh sửa. Sau đó trộn đều và chọn ngẫu nhiên ra 100 lát (mẫu) dé quan sát. Đánh giá phan trăm sự xâm nhiễm của nam rễ trên rễ cà chua theo công
thức của Giovannetti và Mose (1980).
Số mẫu có hiện diện của nấm AM
TỔ lean HH TÔ = Tổng số mẫu quan sát văng
s* Tổng số bào tử/ 100 g đất: Phần đất của các cây được chọn dé lấy chỉ tiêu sẽ được đảo đều theo từng chậu và lấy ngẫu nhiên 100 g đất dé tiến Aanh tách bào tử theo phương pháp sàng ướt của Brundrett và ctv (1996) có chỉnh sửa. Sau đó sẽ tiễn hành đếm tổng số bào tử trên kính hién vi.
Tổng số bào tử của một chỉ
“ Ty lệ xuất hiện (%) = x100
Tổng số bào tử
2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng hạn chế nắm Fusarium solani gây bệnh trên cây cà chua của nắm nội cộng sinh AM trong điều kiện nhà lưới
2.4.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ với 3 lần lặp lại (30 chậu/ nghiệm thức), gồm 6 nghiệm thức, trong đó:
NT 1 (ĐC dương): lây nhiễm nam Fusarium solani NT 2 (ĐC âm): không lây nhiễm nắm Fusarium solani
NT 3 (Acaulospora): Acaulospora sp.
NT 4 (Claroideoglomus): Claroideoglomus sp.
NT 5 (F. solani + Acaulospora): lây nhiễm nam Fusarium solani + Acaulospora sp.
NT 6 (F. solani + Claroideoglomus): lây nhiễm nam Fusarium solani +
Claroideoglomus sp.
2.4.2.2 Cách thức tiến hành
Hạt cà chua được ngâm trong nước ấm với tỷ lệ 3 sôi : 2 lạnh trong 2 giờ sau đó vớt ra và cho vào chiếc khăn âm, ủ tối ở nhiệt độ 25 - 30°C cho đến khi hạt nứt
nanh và gieo hạt cà chua trong khay, khi cà chua được 2 - 3 lá thật sẽ cho ra chậu. Cà
chua sau khi ra chậu sẽ được tiến hành chăm sóc tưới nước đầy đủ và được bón phân NPK 16-16-8 + TE 10 ngày/ lần. Mật số bào tử được chủng vào chậu thí nghiệm: 20 bảo tử/ 100g đất (1000 bào tử/ chậu/ 5 kg đất). Bào tử được chủng vào chậu thí nghiệm sau khi cà chua ra chậu một ngày. Tiến hành chủng nam Fusarium solani cho cà chua sau khi đã xử lý nắm AM được 10 ngày. Trước khi lây nhiễm tưới toản bộ các chậu cây đạt độ âm 70%. Lay nhiễm bằng cách cho 1 dia petri nam Fusarium solani được cắt thành những mảng nhỏ và chôn vào trong đất sâu khoảng 2 — 3 cm xung quanh cây cả chua. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu ở 17 NSC, 24 NSC, 31 NSC và 38 NSC nam AM.
2.4.2.3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
s* Các chỉ tiêu sinh trưởng: Chọn ngẫu nhiên 2 cây/ nghiệm thức/ lần lặp lại ở các thời điểm 17 NSC, 24 NSC, 31 NSC và 38 NSC.
- Chi tiêu chiều cao cây (cm): Do từ gốc đến hết phần ngọn cây.
- Chi tiêu chiều đài rễ (cm): Do từ cổ rễ đến chop đỉnh rễ dài nhất.
- Chi tiêu tổng số rễ (rễ): Đếm tổng số rễ mọc ra từ gốc thân chính.
- Chỉ tiêu sinh khối rễ tươi (gam) được xác định bang cách lấy hết bộ rễ của các cây theo dõi sau khi đo chiều dài rễ đặt lên trên khăn giấy khô và để dưới quạt 10 phút sau đó tiến hành sử dụng cân kỹ thuật dé xác định trọng lượng rễ tươi.
s* Ty lệ nam AM cộng sinh (%): Bộ rễ của cả chua sau khi sau khi thực hiện xong các chỉ tiêu sinh trưởng được tiến hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips và Hayman (1970) có chỉnh sửa. Sau đó trộn đều và chọn ngẫu nhiên ra 100 lát (mẫu) dé quan sát. Đánh giá phần trăm sự xâm nhiễm của nam rễ trên rễ ca chua
theo công thức của Giovannetti và Mose (1980).
Số mẫu có hiện diện của nấm AM
Tỷ lộ cong sinh(%) = Tổng số mau quan sát săn
>ằ Tổng số bao tử/ 100 g đất: Phan đất của cỏc cõy được chon dộ lay chỉ tiờu sẽ được đảo đều theo từng chậu và lay ngẫu nhiên 100g đất dé tiễn hành tách bao tử theo phương pháp sàng ướt của Brundrett và ctv (1996) có chỉnh sửa. Sau đó sẽ tiến hành đếm tổng số bào tử trên kính hiền vi.
s* Kha năng hạn chế nắm bệnh được tính theo công thức Abbott dựa trên tỷ lệ bệnh
(TCVN 12561 - 2018).
E (%) = (1- =~) x 100Ta Ca
Trong đó:
E: Hiệu lực thuốc khảo nghiệm
Ta: Tỷ lệ bệnh ở nghiệm thức xử lý
Ca: Tỷ lệ bệnh ở nghiệm thức không xử lý
Cấp bệnh được đánh giá theo Ahmed và ctv (2010), gồm 5 cấp bệnh:
Cấp 0: không có rễ cây bị thối Cấp 1: 1 - 25% rễ thối
Cấp 2: 26 - 50% rễ thối Cấp 3: 51 - 75% rễ thối